RNA干擾HBx穩(wěn)定表達肝癌細胞株細胞增殖及化療增敏作用的研究.pdf

1、背景及目的： 目前大量實驗研究證實HBx片斷可在多數(shù)并發(fā)乙肝病毒感染的肝癌組織中檢測到，它是肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要因素之一，并可提高肝癌細胞的增殖活性，促進肝癌細胞快速增長。因此，高效特異的基因治療新技術(shù)RNA干擾靶向沉默HBx基因的應(yīng)用是肝癌治療的一種新方法。另一方面，化療仍是目前肝癌治療重要手段之一，但多種化療藥物耐藥性是肝癌治療失敗的主要原因。而相關(guān)研究表明，HBx片斷可通過特異MAPK途徑上調(diào)多藥耐藥基因的表達，并使抗

2、凋亡信號占主導地位，抑制化療藥物誘導的肝癌細胞凋亡。因此我們擬采用針對HBx的RNA干擾技術(shù)與常用的肝癌化療藥物或抗腫瘤藥協(xié)同應(yīng)用，探討RNA干擾技術(shù)和傳統(tǒng)的治療方法聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細胞的生長抑制作用的影響，并選擇高效的治療組合，研究其凋亡機制。 方法： 1.鑒定轉(zhuǎn)染無關(guān)的對照序列(HK3細胞)和針對X基因shRNA(21543細胞)的穩(wěn)定肝癌細胞株：復(fù)蘇三種肝癌細胞(MHCC97-H，HK3，21543細胞)，在含有一定

3、濃度G418的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達，初步估計轉(zhuǎn)染效率并拍照。 2.RT-PCR檢測RNA干擾對HBx基因mRNA沉寂的程度：收集細胞提取總RNA，加用兩對不同引物參照說明進行RT-PCR，根據(jù)凝膠電泳中內(nèi)源基因片段條帶的強弱，來判定模板的量，進而判斷HBX基因的mRNA被siRNA沉寂的程度。 3.觀察RNA干擾后對細胞生長的影響：利用CCK8(Cell countingkit-8)

4、測定光密度值，繪制三種不同細胞6天的不同增殖曲線。 4.流式細胞儀檢測細胞周期的變化。 5.繪制加用三種不同濃度的5-氟脲嘧啶，順鉑，α-干擾素的肝癌細胞的生長曲線，選擇最佳組合。 6.TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。 結(jié)果： 1.復(fù)蘇后細胞形態(tài)和GFP表達強度差別不大。 2.RT-PCR結(jié)果顯示相對于MHCC-97H細胞，21543細胞的HBxmRNA水平的下調(diào)顯著，HK3細胞

5、的HBx mRNA水平的下調(diào)不明顯。 3.靶向HBX的RNA干擾后的肝癌細胞(21543細胞)較原肝癌細胞(MHCC97-H細胞)和轉(zhuǎn)染無關(guān)對照序列的肝癌細胞(HK3細胞)增殖明顯減慢，后兩種細胞差別不顯著。 4.21543細胞的細胞周期顯示RNA干擾后的肝癌細胞延緩進入S期，增殖活性明顯降低。 5.三種不同細胞加用三種不同濃度的5-氟脲嘧啶，順鉑后細胞生長明顯減慢，并呈濃度依賴性，以RNA干擾HBx后的肝癌細胞

6、(21543細胞)生長抑制最明顯，加用干擾素后細胞抑制不明顯。 6.相同濃度的化療藥物5-氟脲嘧啶作用上述三種不同肝癌細胞均可引起細胞凋亡，以RNA干擾后的肝癌細胞(21543細胞)最為明顯。 結(jié)論： 1.RNA干擾HBx可明顯抑制肝癌細胞的增長，細胞周期發(fā)生改變。 2.RNA干擾HBx后的肝癌細胞可明顯增強化療敏感性。 3.RNA干擾HBx和化療藥物二者聯(lián)合應(yīng)用肝癌細胞凋亡更為明顯，細胞增殖明顯