RNAi靶向沉默AFP對人HepG2細胞株細胞增殖及周期相關基因表達的影響.pdf

1、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是哺乳動物的一種重要胚胎蛋白，出生后其血清濃度迅速下降，正常情況下，成人中AFP的合成被抑制。自四十年前在血清中被發(fā)現(xiàn)以來，AFP一直被視為腫瘤標志物的黃金標準。作為腫瘤相關胚胎蛋白，人們對AFP進行了純化、鑒定、克隆以及測序用于臨床診斷。然而，人們對AFP調(diào)節(jié)腫瘤生長的生物學作用關注較少。直到近十年，研究學者們才認識到AFP這方面的生物作用，并開始對其進行研究。目前，研究學者們一致

2、認為AFP對腫瘤生長的調(diào)節(jié)作用是通過細胞表面AFP受體介導的內(nèi)吞作用實現(xiàn)的。放射自顯影報道以及AFP在抗癌藥物軛合物方面的應用都證明該胚胎蛋白可以被細胞內(nèi)吞。AFP及其多肽片段作為生長反應修飾劑具有重要的應用，例如凋亡G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導，基因治療，疫苗以及癌癥預防。雖然人們對AFP的理化以及免疫學特性進行了大量的研究，然而其在胚胎發(fā)育以及成人癌癥發(fā)生過程中的作用及機制仍然不清楚。 為了研究AFP對體外培養(yǎng)肝癌細胞系的增殖作用，

3、我們設計了小干擾RNA(siRNA)，通過Biotex質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染試劑將優(yōu)化后的shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人肝癌細胞HepG2細胞株，并以未轉(zhuǎn)染的．HepG2細胞株及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞株作為對照。通過RT-PCR的方法在mRNA水平上檢測AFP的沉默效果，MTT法檢測AFP基因沉默對細胞增殖的抑制作用，流式細胞技術分析AFP基因沉默對細胞周期的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)AFP沉默對體外細胞生長具有明顯的抑制作用，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞相

4、比，AFP沉默的人肝癌細胞HepG2細胞株細胞增殖能力受到抑制。AFP沉默的：HepG2細胞S期分布比率由17.67％提高到38.56％，而G(2)/M期分布比率下降。通過半定量PCR(semiquantitivepolymerase chain reaction)法發(fā)現(xiàn)AFP沉默后的HepG2細胞促凋亡基因內(nèi)bax表達量上調(diào)而抑凋亡基因bcl-2表達量下降。 同時，我們還通過流式細胞技術，以及mRNA水平上檢測周期相關基因研究

5、了AFP沉默與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)，干擾素-α(interferon-alpha，IFN-α)以及地塞米松磷酸鈉(dexamethasone sodium phosphate)藥物處理的協(xié)同作用。我們發(fā)現(xiàn)AFP基因沉默促進了藥物對細胞周期的阻滯作用，并發(fā)現(xiàn)AFP基因沉默與藥物協(xié)同作用后，促凋亡基因內(nèi)bax表達量上調(diào)，抑凋亡基因bcl一2表達量下降，同時與細胞周期相關的基因cyclinD和p21表達量上調(diào)。