RNAi靶向沉默AFP對(duì)人HepG2細(xì)胞株細(xì)胞增殖及周期相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是哺乳動(dòng)物的一種重要胚胎蛋白，出生后其血清濃度迅速下降，正常情況下，成人中AFP的合成被抑制。自四十年前在血清中被發(fā)現(xiàn)以來，AFP一直被視為腫瘤標(biāo)志物的黃金標(biāo)準(zhǔn)。作為腫瘤相關(guān)胚胎蛋白，人們對(duì)AFP進(jìn)行了純化、鑒定、克隆以及測(cè)序用于臨床診斷。然而，人們對(duì)AFP調(diào)節(jié)腫瘤生長的生物學(xué)作用關(guān)注較少。直到近十年，研究學(xué)者們才認(rèn)識(shí)到AFP這方面的生物作用，并開始對(duì)其進(jìn)行研究。目前，研究學(xué)者們一致

2、認(rèn)為AFP對(duì)腫瘤生長的調(diào)節(jié)作用是通過細(xì)胞表面AFP受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)的。放射自顯影報(bào)道以及AFP在抗癌藥物軛合物方面的應(yīng)用都證明該胚胎蛋白可以被細(xì)胞內(nèi)吞。AFP及其多肽片段作為生長反應(yīng)修飾劑具有重要的應(yīng)用，例如凋亡G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因治療，疫苗以及癌癥預(yù)防。雖然人們對(duì)AFP的理化以及免疫學(xué)特性進(jìn)行了大量的研究，然而其在胚胎發(fā)育以及成人癌癥發(fā)生過程中的作用及機(jī)制仍然不清楚。 為了研究AFP對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系的增殖作用，

3、我們?cè)O(shè)計(jì)了小干擾RNA(siRNA)，通過Biotex質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染試劑將優(yōu)化后的shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株，并以未轉(zhuǎn)染的．HepG2細(xì)胞株及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株作為對(duì)照。通過RT-PCR的方法在mRNA水平上檢測(cè)AFP的沉默效果，MTT法檢測(cè)AFP基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞技術(shù)分析AFP基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFP沉默對(duì)體外細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相

4、比，AFP沉默的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力受到抑制。AFP沉默的：HepG2細(xì)胞S期分布比率由17.67％提高到38.56％，而G(2)/M期分布比率下降。通過半定量PCR(semiquantitivepolymerase chain reaction)法發(fā)現(xiàn)AFP沉默后的HepG2細(xì)胞促凋亡基因內(nèi)bax表達(dá)量上調(diào)而抑凋亡基因bcl-2表達(dá)量下降。 同時(shí)，我們還通過流式細(xì)胞技術(shù)，以及mRNA水平上檢測(cè)周期相關(guān)基因研究

5、了AFP沉默與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)，干擾素-α(interferon-alpha，IFN-α)以及地塞米松磷酸鈉(dexamethasone sodium phosphate)藥物處理的協(xié)同作用。我們發(fā)現(xiàn)AFP基因沉默促進(jìn)了藥物對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，并發(fā)現(xiàn)AFP基因沉默與藥物協(xié)同作用后，促凋亡基因內(nèi)bax表達(dá)量上調(diào)，抑凋亡基因bcl一2表達(dá)量下降，同時(shí)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因cyclinD和p21表達(dá)量上調(diào)。