siRNA對胃腺癌細胞株SGC-7901VEGF基因表達的影響.pdf

1、目的: 利用siRNA(8mall interferference RNA)抑制VEGF基因表達對人胃腺癌細胞S6C-7901增殖和凋亡的影響。 方法： (1)體外轉(zhuǎn)錄siRNA：選擇血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因為靶基因，設(shè)計針對VEGFmRNA的小干擾RNA，合成DNA寡核菅酸，體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA. (2)將siRNA轉(zhuǎn)染入靶細胞：以SGC-7901人胃腺癌細胞系為靶細胞，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將siR

2、NA導(dǎo)入細胞。 (3)觀察轉(zhuǎn)染后癌細胞的變化：MTT法檢測細胞存活率，Hoechst33258染色觀察siRNA作用細胞后出現(xiàn)凋亡小體的情況，流式細胞儀檢測細胞周期的改變，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后VEGFmRNA表達水平的變化，ELISA檢測VEGF蛋白表達的下降效果。 結(jié)果： (1)體外轉(zhuǎn)錄的針對VEGFmRNA兩個靶位點的siRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞后均能有效抑制腫瘤細胞的生長，而作為陰性對照組的錯義序列s

3、iRNA完全不起作用。 (2)轉(zhuǎn)染后24小時用MTT法檢測各組SGC-1901細胞代謝率的統(tǒng)計結(jié)果顯示：低、中、高劑量組的MTT代謝率明顯低于正常對照組，與錯義對照組(即siRNA<,SCR>組)比較有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；極高劑量組的MTT代謝率也低于錯義對照組，其與錯義對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。錯義序列組、脂質(zhì)體組與正常對照組比較沒有顯著差異(P>0.05)。 (3)Hoechst33258染

4、色觀察：轉(zhuǎn)染siRNA 48h后，熒光顯微鏡下觀察到細胞核染色質(zhì)高度凝聚，并裂解成碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 (4)流式細胞儀檢測到siRNA作用的細胞G<,0>/G<,1>期(細胞靜止期和DNA合成前期)比例升高，S期和G<,2>/M期(DNA合成期與有絲分裂期)比例降低，錯義序列組、脂質(zhì)體組無此變化； (5)轉(zhuǎn)染后24小時siRNA<,1>和siRNA<,2>組的RT-PCR結(jié)果顯示其VEGF mRNA表達量明顯下降。

5、 (6)轉(zhuǎn)染后24小時后，siRNA<,1>和siRNA<,2>組的VEGF分泌含量也明顯顯著降低，然而作為陰性對照的錯義序列組siRNA<,SCR>則沒有這種效果，不起作用。 結(jié)論： (1)應(yīng)用生物軟件所設(shè)計出來的針對兩個靶位點的siRNA均能有效抑制VEGF蛋白的表達和細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，改變細胞周期，為腫瘤的基因治療提供了新思路。 (2)在胃腺癌的抗血管生成基因治療中VEGF是有效的靶位點。