RNA干擾HER-2基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞株SKBr3細(xì)胞周期及增殖影響的研究.pdf

1、目的：觀察載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能否有效抑制人乳腺癌細(xì)胞株SKBr3表皮生長因子受體2(HER-2)的表達(dá)及其對細(xì)胞周期及體外增殖力的影響。方法：構(gòu)建2個針對HER2基因表達(dá)短發(fā)夾狀siRNA的真核表達(dá)載體(pshRNA-HER2)并轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株SKBr3,逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72hHER2基因mRNA和蛋白表達(dá)，從中篩選出基因沉默效果好的靶位點(diǎn)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，四甲基偶

2、氮唑鹽MTT比色分析及集落形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞體外增殖活力。同時構(gòu)建針對綠色熒光蛋白基因的短發(fā)夾狀siRNA的真核表達(dá)載體pshRNA-GFP作為陽性對照。 結(jié)果：酶切與測序證實(shí)真核表達(dá)載體pshRNA．HER2．1、pshRNA—HER2-2、pshRNA．GFP構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，pshRNA．HER2．1、pshRNA—HER2-2質(zhì)粒均能抑制HER2基因表達(dá)，與空白對照組比較，pshRNA．HER2．1轉(zhuǎn)染組基因表達(dá)

3、抑制率為65．5％，pshRNA．HER2-2轉(zhuǎn)染組基因表達(dá)抑制率為32％，二者之中pshRNA．HER2．1抑制作用明顯，進(jìn)一步檢測其對細(xì)胞周期及增殖力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，pshRNA—HER2．1轉(zhuǎn)染組改變了細(xì)胞周期分布(G0-G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加了9．84％，進(jìn)入S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少了18％，細(xì)胞凋亡達(dá)12．39％)，細(xì)胞生長抑制率達(dá)48．2％，集落形成抑制達(dá)52．5％。同時pshRNA．nonspecial轉(zhuǎn)染組對

4、HER2基因表達(dá)、細(xì)胞周期及增殖力無明顯影響。倒置熒光顯微鏡下觀測到pshRNA-GFP轉(zhuǎn)染后明顯抑制綠色熒光蛋白基因的表達(dá)。 結(jié)論：1．pshRNA-HER2真核表達(dá)載體構(gòu)建成功； 2．pshRNA-HER2-1、pshRNA-HER2-2均可有效抑制SKBr3HER2基因的表達(dá)； 3．NM004448(507-528)：AAGGACATCTTCCACAAGAAC是抑制效率較高的HER2基因RNA干擾靶位點(diǎn)；