nucleostemin基因在腎癌中的表達(dá)及其與腫瘤增殖活性的關(guān)系.pdf

1、[目的]腎癌也被稱為腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)，是最常見的腎實質(zhì)惡性腫瘤，也是泌尿系統(tǒng)最為常見的腫瘤之一，在我國泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌，約占成年人全身惡性腫瘤的3％，而在原發(fā)腎臟惡性腫瘤中可占85％～90％，是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。腎癌的發(fā)生機制十分復(fù)雜，具體、特定的病因至今尚不十分明確。腎癌的發(fā)病機理及發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)至今亦尚不明了，其分子生物學(xué)行為復(fù)雜多變。目前，人

2、們對腎癌相關(guān)的分子標(biāo)志物及其表達(dá)產(chǎn)物的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了大量的腎癌相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物。近年來，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的進(jìn)展越來越大的幫助了人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的認(rèn)識，也為臨床上對腫瘤的進(jìn)一步診斷和治療提供了有用的參考，并為將來更好的診斷和治療腎癌提供了廣闊的前景。nucleostemin是2002年Tsai等報道的一種新的p53結(jié)合蛋白，定位于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，參與干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控，能維持干細(xì)胞的擴增并抑制

3、其向成熟細(xì)胞分化。這引發(fā)了人們對干細(xì)胞和腫瘤相關(guān)性的高度關(guān)注。由此，nucleostemin成為在調(diào)節(jié)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖與分化中令人非常感興趣的蛋白，現(xiàn)在nucleostemin已被作為干細(xì)胞的標(biāo)記。并且有人提出干細(xì)胞與癌細(xì)胞均能不斷的自行復(fù)制，其背后的分子機制可能是相同的：干細(xì)胞與癌細(xì)胞的增生，均由nucleostemin蛋白質(zhì)來決定其細(xì)胞復(fù)制的能力。增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，

4、PCNA)是近年來研究比較多的一種在細(xì)胞周期S期廣泛表達(dá)的一種非組蛋白型核蛋白，PCNA的陽性程度可直接反映DNA復(fù)制的活躍程度，可作為研究細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項重要指標(biāo)。nucleostemin基因與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系目前尚不清楚，有關(guān)這方面的報道尚未見報道，因此本實驗采用RT-PCR的方法從RNA水平研究nucleostemin基因在腎癌組織中的表達(dá)；應(yīng)用免疫組化方法研究PCNA蛋白的表達(dá)，從而明確腎癌組織中nucleostemin基

5、因的表達(dá)與腫瘤增殖活性的關(guān)系。探討nucleostemin基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，試圖為腎癌的防治提供實驗依據(jù)，針對腎癌細(xì)胞過度增殖尋找臨床治療和預(yù)防的途徑具有重要意義。 [材料與方法]收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2003年11月至2005年8月期間手術(shù)切除的腎癌組織標(biāo)本62例。其中男性患者35例，女性患者27例，年齡在29歲～78歲之間，平均56.6歲。組織類型：透明細(xì)胞型50例，顆粒細(xì)胞型12例。Robson分期：

6、Ⅰ期17例，Ⅱ期22例，Ⅲ期18，Ⅳ期5例。按Thoenes分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級：G1、G2、G3級分別為13例、27例、22例。同時取10例癌旁非癌腎組織和10例非瘤正常腎組織作對照組。癌旁非癌腎組織取自距瘤緣2cm以上。所有標(biāo)本患者術(shù)前均未行放化療、免疫治療及腎動脈栓塞治療；所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實。全部標(biāo)本取一半新鮮組織放于EP管中，液氮浸泡10分鐘后，保存于-80℃冰箱，用于RT-PCR；另一半組織用福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，

7、4μm厚連續(xù)切片。利用RT-PCR方法以GAPDH為內(nèi)參照，檢測上述組織nucleostemin基因mRNA的表達(dá)，使用小鼠抗人PCNA單克隆抗體，通過通用型二步免疫組化染色法，檢測PCNA抗原在62例RCC組織及20例正常腎組織中的表達(dá)。統(tǒng)計分析采用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，a=0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。 [結(jié)果]1.nucleostemin基因陽性表達(dá)表現(xiàn)為在RT-PCR凝膠成像中，在570bp位置

8、顯示一條條帶，陰性表達(dá)表現(xiàn)為僅有內(nèi)參(GAPDH)的條帶。在62例腎癌組織中，nucleostemin基因47例顯示陽性表達(dá)，陽性率為75.81％。正常腎組織未見有nucleostemin基因陽性表達(dá)。nucleostemin基因在腎癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于正常腎組織，二者比較差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。nucleostemin基因在透明細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率為74.00％；顆粒細(xì)胞癌陽性表達(dá)率為83.33％，二者相比較差異性

9、不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。nucleostemin基因表達(dá)率隨著腎癌臨床分期升高而增加，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期的表達(dá)率分別是52.94％、68.18％、100.00％、100.00％。合并Ⅲ期、Ⅳ期進(jìn)行比較，三者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)；Ⅰ期與Ⅲ及Ⅳ期之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)，Ⅱ期與Ⅲ及Ⅳ期之間差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)。nucleostemin基因在病理分級G1、G2、G3中的陽性

10、表達(dá)率分別為46.15％、77.78％、90.91％，三者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)，G1與G3之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)。 2.腎癌組織中，PCNA蛋白表達(dá)的陽性信號主要定位于癌細(xì)胞胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色，并且陽性細(xì)胞呈片狀分布，62例中有44例顯示陽性表達(dá)，陽性率為70.97％。正常腎組織PCNA蛋白的陽性表達(dá)，陽性表達(dá)細(xì)胞在腎小管或/和腎小球細(xì)胞中也呈片狀分布。20例正常腎組織中有3例PCN

11、A蛋白呈陽性表達(dá)，陽性率為15.00％。PCNA蛋白在腎癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于正常腎組織，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。PCNA蛋白透明細(xì)胞癌與顆粒細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率分別為72.00％、66.67％，二者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。PCNA蛋白在腎癌的臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期中的陽性表達(dá)率分別為52.94％、59.09％、94.44％、100.00％，表達(dá)率隨著腎癌臨床分期升高而增加，合并Ⅲ期、Ⅳ期

12、進(jìn)行比較，三者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；Ⅰ期與Ⅲ及Ⅳ期之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)，Ⅱ期與Ⅲ及Ⅳ期之間差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)。PCNA蛋白在病理分級G1、G2、G3中的陽性表達(dá)率分別為23.08％、74.07％、95.45％，三者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；G1與G2之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)，G1與G3之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167)。 3

13、.在62例腎癌組織中，nucleostemin基因和PCNA蛋白二者表達(dá)共陽性39例，共陰性10例；nucleostemin基因呈陽性表達(dá)，PCNA蛋白陰性表達(dá)的8例；nucleostemin基因呈陰性表達(dá)，PCNA蛋白陽性表達(dá)的5例。二者在腎癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。 [結(jié)論]1.nucleostemin基因在腎癌組織中呈高表達(dá)，而在正常腎組織中無表達(dá)；nucleostemin基因的表達(dá)可能與病理類型無關(guān)，而

14、與臨床分期、病理分級有關(guān)，在晚期腎癌中的表達(dá)顯著高于早、中期腎癌，高分級腫瘤高于低分級腫瘤，提示nucleostemin基因的表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以作為評價腎癌惡性程度的指標(biāo)之一。 2.PCNA在腎癌組織中呈高表達(dá)，在正常腎組織中表達(dá)降低，PCNA的表達(dá)可能與病理類型無關(guān)，而與病理分級、臨床分期有關(guān)，在晚期和較高分級腎癌中的表達(dá)高于中、早期和較低分級的腎癌，提示PCNA的表達(dá)可以作為評價腎癌增殖活性的指標(biāo)之一。