瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)應對低氧脅迫的分子機制研究.pdf

1、在水生生態(tài)系統(tǒng)中，由于季節(jié)變化、光合作用、風、鹽度、溫度、晝夜變化等自然因素以及環(huán)境污染、水體富營養(yǎng)化和全球變暖問題等人為因素的存在，氧氣含量可在時間和空間上發(fā)生劇烈變化。此外，在常見的高密度、淺池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，高養(yǎng)殖密度以及高營養(yǎng)輸入導致增殖的浮游動植物引發(fā)水華，使得水體溶解氧含量低且不穩(wěn)定，成為魚類養(yǎng)殖的一個巨大威脅。雖然魚類已經(jīng)具備了在低氧水域環(huán)境下存活的能力，但是這種生存能力是依賴于一套完整的氧氣感受、基因-蛋白互作調(diào)控等應

2、對機制。目前低氧脅迫研究已經(jīng)成為魚類生理學的熱點之一，然而關于瓦氏黃顙魚應對低氧脅迫的分子調(diào)控機制的研究未見報道。
　　瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）是黃顙魚屬魚類中個體最大的一種，最大個體體質(zhì)量達1850g，但是該魚耐低氧能力較黃顙魚差，連續(xù)陰雨天氣、密度過高等導致的低氧會致使其死亡，該魚在中國高密度池塘養(yǎng)殖較少，但其具有生長速度快、食性雜、容易馴養(yǎng)、肉味鮮美等優(yōu)點，同樣也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個很有養(yǎng)殖前景的

3、品種，而且在日本、韓國、東南亞等國家也有巨大的市場潛力，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種。目前，瓦氏黃顙魚產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，迫切需要培育耐低氧新品種，這也是瓦氏黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要條件。然而至今為止，該物種只有少數(shù)EST和蛋白質(zhì)序列可用，遺傳資源的缺乏嚴重阻礙了其在分子育種以及特定生物學過程中的深入研究?？梢?，瓦氏黃顙魚的這些特征表現(xiàn)出它不僅僅是一個具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，而且是一個潛在的可以用來研究低氧和再氧化分子調(diào)節(jié)機制的

4、模型物種。
　　本論文以瓦氏黃顙魚為實驗對象，一方面，運用第二代測序技術對低氧脅迫前后(溶氧量0.7mg/L;4h)瓦氏黃顙魚肝臟的轉錄組、miRNA組、蛋白質(zhì)組進行聯(lián)合和對比研究;另一方面，研究了低氧脅迫(溶氧量0.7mg/L;1.5h，4h，6.5h)和恢復下(溶氧量6.8mg/L;1.5h，4h，6.5h)對瓦氏黃顙魚氧傳感蛋白、呼吸代謝及血液指標的影響，同時在低氧脅迫和恢復下對瓦氏黃顙魚氧化應激參數(shù)進行分析，期望在分子水平

5、上系統(tǒng)地闡明魚類應對低氧脅迫的分子調(diào)控機制，也為今后開展魚類耐低氧新品種選育提供一定的理論依據(jù)。本論文研究結果主要包括以下4個部分:
　　1.低氧脅迫下瓦氏黃顙魚肝臟mRNA-seq和miRNA-seq聯(lián)合分析（轉錄水平）
　　通過miRNA組和轉錄組測序分析低氧脅迫前后瓦氏黃顙魚肝臟共獲得18個差異miRNA和961個差異mRNA，結合miRNA預測的靶基因進行聯(lián)合分析后共獲得162個negative miRNA-mRNA

6、 pairs，包括18個差異miRNA和107個mRNA。對所涉及到的轉錄組和聯(lián)合分析的差異基因進行KEGG pathway富集性分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的綜合分析以及對21個差異基因(PFKL、HK、LDH、PGAM、LPL、BCL2、Vhl、TFRC、SLC2A1、VEGF、EPO、DAPK、JUN、ANGPTL4、CA、PRKAG2、ATF2、CREM、IRS、Akt和DUSP8）和13個差異miRNA(miR-143、miR-17、miR

7、-27b、miR-301c、miR-338、miR-3618、miR-210、PC-3p-36625_60、PC-5p-83983_9、miR-338、miR-16a、miR-20a和miR-301a)進行qRT-PCR驗證，結果顯示瓦氏黃顙魚為了在急性低氧條件下維持正常的生理活動，在轉錄水平上通過miRNA-mRNA pairs調(diào)控一些重要的信號通路（如HIF-1signaling pathway、Glycolysis/Glucone

8、ogenesis、AMPK signaling pathway等）并導致一系列生物學過程，包括促進血紅細胞增殖，促進血管生成，抑制細胞凋亡;有氧代謝和無氧代謝的轉換;減少能量消耗和生物合成。
　　2.低氧脅迫和恢復對瓦氏黃顙魚氧傳感蛋白、呼吸代謝及血液指標的影響
　　以HIF-1signaling pathway為主線，系統(tǒng)地開展瓦氏黃顙魚低氧脅迫下大腦和肝臟組織相關基因、蛋白、酶活性的時序表達研究，通過qRT-PCR分析發(fā)

9、現(xiàn)氧傳感蛋白（HIFs、PHDs、F1H和Vhl）在肝臟或大腦中表達較高。在低氧脅迫和恢復條件下，氧傳感蛋白mRNA表達量和HIF-1α蛋白表達量都顯著上調(diào)，這些氧傳感蛋白（尤其是HIF-1α）可以作為環(huán)境低氧的分子指標;同時，在低氧下上調(diào)的PHDs可能在恢復下反饋調(diào)節(jié)HIFs以終止低氧反應;瓦氏黃顙魚在低氧和恢復下:通過提高RBC、HB和SI來增加血液攜帶氧氣的能力，通過提高糖酵解相關酶活性（PFK、HK和PK）和無氧呼吸關鍵酶(LD

10、H)來增加無氧呼吸能力，同時低氧下在肝臟組織中降低了有氧呼吸酶活性(CS)來抑制有氧呼吸。以上生物學過程是瓦氏黃顙魚為了應對低氧和恢復下能夠進行正常生命活動獲取能量所作出的代謝改變，代謝模式為有氧呼吸至無氧呼吸的轉變。
　　3.低氧脅迫下瓦氏黃顙魚肝臟差異蛋白質(zhì)組學分析（翻譯水平）
　　通過基于iTRAQ的蛋白質(zhì)測序分析低氧脅迫前后瓦氏黃顙魚肝臟共獲得511個差異蛋白，在對511差異表達蛋白的KEGG pathway富集性分

11、析中，“Metabolism”是被富集到最多的生物學過程大類別，包括幾個重要的生物學過程小類別“Xenobiotics biodegradation and metabolism”、“Lipid metabolism”、“Carbohydrate metabolism”和“Amino acid metabolism”幾個子類。值得注意的是一些重要的pathway同樣被富集到，如Peroxisome（屬于“Transport and ca

12、tabolism”pathway小類別）和PPAR signaling pathway（屬于“Endocrine system”pathway小類別）。根據(jù)在翻譯水平上數(shù)據(jù)的綜合分析以及對6個差異基因(PCK1、TGL2、MGEA5、PGAM1、UGT2A2、HYI)和6個差異蛋白（PCK1、PGAM1、TGL2、TAT、PGK1、MDH1）的驗證，結果表明瓦氏黃顙魚肝臟低氧適應生物學過程是Peroxisome和PPAR signali

13、ng pathway主導過氧化物的降解和代謝以及脂質(zhì)代謝，另外代謝模式為有氧代謝至無氧代謝的轉換以及減少能量消耗和生物合成。
　　4.低氧脅迫和恢復對瓦氏黃顙魚氧化應激損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響
　　為了探究低氧脅迫和恢復對瓦氏黃顙魚氧化應激損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響，首先對瓦氏黃顙魚SOD1和SOD2基因的eDNA全長進行序列分析以及組織表達進行分析，結果表明SOD1在肝臟中表達最高，而SOD2在心臟和大腦中表達較高。然后對瓦氏黃

14、顙魚在低氧脅迫和恢復中SODs基因和蛋白的表達水平進行系統(tǒng)研究，同時對氧化應激參數(shù)（MDA、CP和LPO）及抗氧化酶(GR、CAT、GST、GPx和SOD)進行檢測，結果表明在瓦氏黃顙魚肝臟中抗氧化酶（CAT、GST、GPx和SOD）在機體面臨氧化應激之前逐漸升高，與M.Hermes-Lima提出的猜想“氧化應激準備”相一致。在瓦氏黃顙魚大腦中，氧化應激參數(shù)（CP和LPO）在低氧脅迫下降低，而且抗氧化酶(SOD、GPx、GST、GR)也

15、顯著降低，表明了環(huán)境低氧導致瓦氏黃顙魚大腦組織中新陳代謝減痕以減少ATP的利用，從而減少線粒體呼吸鏈上電子的攜帶和殘留氧氣分子的電子傳遞以減少ROS的水平，減少氧化應激對大腦的負面影響，這也驗證了魚類在低氧下，為保護心臟或大腦這類對生存起重要作用的組織，血液會重新分配以保證這些組織在低氧狀態(tài)下能夠維持基本生存。在恢復條件下，瓦氏黃顙魚肝臟和大腦中氧化應激參數(shù)及抗氧化酶都顯著升高，這表明了伴隨著大量氧氣的輸入導致代謝補償，ROS的濃度迅速