瓦氏黃顙魚雌性蛋白的純化、性質(zhì)鑒定及酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立.pdf

1、腹腔注射17β—雌二醇(E2)，使瓦氏黃顙魚(P．vachelli)雄魚在7d內(nèi)產(chǎn)生卵黃蛋白原(Vtg)。采用凝膠過濾和離子交換兩步層析法、Mg2+—EDTA選擇性沉淀和凝膠過濾層析兩步法、Mg2+—EDTA選擇性沉淀和電洗脫兩步法等三種技術(shù)，從E2誘導(dǎo)的雄性瓦氏黃顙魚血漿中分離、純化Vtg，采用糖、磷、脂蛋白染色技術(shù)證明分離、純化的蛋白為Vtg，該Vtg在非變性條件下分子量約為240kDa，在SDS變性條件下分子量約為143kDa。純

2、化的瓦氏黃顙魚Vtg經(jīng)檢測顯示可能含有類胡蘿卜素，但沒有二硫鍵，對熱相對穩(wěn)定。利用純化的瓦氏黃顙魚Vtg，制備了兔抗瓦氏黃顙魚Vtg多克隆抗血清。用雙向免疫擴(kuò)散法測得抗血清的純度較高，效價為1：32：Western blotting檢測顯示抗血清的特異性較好。以瓦氏黃顙魚Vtg多克隆抗血清為抗體，以純化的瓦氏黃顙魚Vtg為抗原，建立了間接酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法檢測瓦氏黃顙魚體內(nèi)Vtg的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性部分的線性方程為y=0

3、.099x+0.4529(R2=0.9327)，該方法檢測的靈敏度為15.6ng/ml，工作范圍為31.2-4000ng/ml，在此范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性。 采用凝膠過濾和離子交換兩種層析技術(shù)，從瓦氏黃顙魚Ⅳ期卵巢粗體液中分離、純化Lv，采用糖、磷、脂蛋白染色技術(shù)證明分離、純化的蛋白為Lv，該Lv在非變性條件下分子量約為230kDa，在SDS變性條件下分子量約為106kDa。純化的瓦氏黃顙魚Lv經(jīng)檢測顯示可能含有類胡蘿卜