忍冬屬藥材的種質(zhì)遺傳多樣性及其質(zhì)量研究.pdf

1、目的：
　　研究忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、灰氈毛忍冬（Lonicera.macranthiodes Hand-Mazz.）、黃褐毛忍冬（Lonicerafulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng.）、紅腺忍冬(Lonicera.hypoglaucaMiq.)、華南忍冬（Lonicera.confusa DC.）等忍冬屬藥材5種基原植物的遺傳多樣性水平，并對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。

2、　　方法：
　　1.采用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)檢測忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬等忍冬屬藥材5種基原植物的遺傳多樣性水平，得到DNA指紋圖譜。利用NTSYS軟件處理數(shù)據(jù)，UPGMA構(gòu)建聚類圖;Mantel檢測法對兩種標(biāo)記進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。
　　2.用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增5種植物樣本的rbcL基因片段，ClustalX1.83軟件對所得序列進(jìn)行全比對，MEGA4.0

3、軟件分析各樣本rbcL序列特征。
　　3.以綠原酸、木犀草苷等有效成分為研究對象，應(yīng)用METLC法對忍冬屬藥材進(jìn)行鑒別研究。固定相采用聚酰胺薄膜，展開劑選用SDS-正丁醇-正庚烷-水組成的微乳液，使用CAMAG薄層色譜分析儀對數(shù)據(jù)及圖像進(jìn)行處理，并構(gòu)建METLC指紋圖譜。
　　4.HPLC檢測有效成分含量:使用Kromasil C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μ m），以1％冰醋酸-乙腈為流動(dòng)相，采用梯度洗脫法，使

4、用DAD檢測器在350 nm波長處檢測綠原酸、木犀草苷的有效成分含量，并以此成分為研究對象構(gòu)建HPLC指紋圖譜。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)篩選的16條ISSR引物和22對SRAP引物分別擴(kuò)增出232、215條條帶，多態(tài)性條帶分別占到201、154條，得到的DNA指紋圖譜可清晰區(qū)別5種植物;UPGMA將5種忍冬屬植物聚為A、B兩大類，A類為金銀花基原植物，B類為山銀花基原植物，B類中，黃褐毛忍冬單獨(dú)聚為一支，其余種聚為一支;兩

5、種標(biāo)記技術(shù)相關(guān)系數(shù)(r)為0.9703，呈顯著正相關(guān)性。
　　2.5種忍冬屬藥用植物rbcL基因序列長度在1143～1167 bp之間，手工校正后長度為1137 bp，保守位點(diǎn)1126個(gè)，變異位點(diǎn)11個(gè)，簡約信息位點(diǎn)6個(gè);紅腺忍冬、灰氈毛忍冬和華南忍冬之間堿基序列幾乎相同，這三者與忍冬之間變異堿基有9個(gè)，與黃褐毛忍冬之間變異堿基有8個(gè)，忍冬與黃褐毛忍冬間變異堿基有5個(gè)。
　　3.METLC實(shí)驗(yàn)確定出以含水量為75％的微乳液(

6、SDS-正丁醇-正庚烷-水=6.7∶15.8∶2.5∶75)-甲酸=9∶1為最佳展開劑，得到的斑點(diǎn)清晰、分離度好，數(shù)量多達(dá)12個(gè)，能有效的鑒別各藥材;以綠原酸和木犀草苷有效成分構(gòu)建的METLC指紋圖譜可反應(yīng)金銀花藥材與山銀花藥材在化學(xué)成分上的差異，并可區(qū)別山銀花藥材4種基原植物間化學(xué)成分的異同，5個(gè)樣品生成的指紋圖譜共有6條共有峰。
　　4.經(jīng)HPLC-DAD檢測，各樣品有效成分含量均達(dá)到《中國藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，木犀草苷成分僅在金銀

7、花中檢測出，綠原酸在金銀花和山銀花中均存在，其含量在灰氈毛忍冬中最高，在華南忍冬中最少;HPLC指紋圖譜共產(chǎn)生5個(gè)共有峰，從各樣品非共有峰可區(qū)別金銀花和山銀花藥材之間以及山銀花藥材4種基原植物間化學(xué)成分的差異。
　　結(jié)論：
　　ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記有效揭示了忍冬屬藥材5種基原植物的多樣性水平，兩種標(biāo)記形成的UPGMA聚類結(jié)果顯示，金銀花藥材基原植物忍冬與山銀花藥材的4種基原植物遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，兩類藥材在基因水平上存在

8、一定差異。
　　5種植物的rbcL基因序列差異顯示，金銀花基原植物與山銀花基原植物間rbcL堿基序列存在差異，山銀花基原植物中黃褐毛忍冬與其余三個(gè)種差異較為明顯，以上結(jié)果與ISSR和SRAP分子標(biāo)記中聚類結(jié)果一致。
　　METLC技術(shù)相比傳統(tǒng)TLC技術(shù)更加簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，能有效鑒別金銀花藥材和山銀花藥材，并有效區(qū)別山銀花的4種基原植物，能夠應(yīng)用于金銀花和山銀花藥材的質(zhì)量控制。
　　本課題綜合從分子水平以及化學(xué)成分水平