忍冬屬藥材的種質(zhì)遺傳多樣性及其質(zhì)量研究.pdf

1、目的：
　　研究忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、灰氈毛忍冬（Lonicera.macranthiodes Hand-Mazz.）、黃褐毛忍冬（Lonicerafulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng.）、紅腺忍冬(Lonicera.hypoglaucaMiq.)、華南忍冬（Lonicera.confusa DC.）等忍冬屬藥材5種基原植物的遺傳多樣性水平，并對其質(zhì)量進行評價。

2、　　方法：
　　1.采用ISSR和SRAP分子標記技術檢測忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬等忍冬屬藥材5種基原植物的遺傳多樣性水平，得到DNA指紋圖譜。利用NTSYS軟件處理數(shù)據(jù)，UPGMA構建聚類圖;Mantel檢測法對兩種標記進行相關性檢驗。
　　2.用Primer Premier5.0軟件設計引物，PCR擴增5種植物樣本的rbcL基因片段，ClustalX1.83軟件對所得序列進行全比對，MEGA4.0

3、軟件分析各樣本rbcL序列特征。
　　3.以綠原酸、木犀草苷等有效成分為研究對象，應用METLC法對忍冬屬藥材進行鑒別研究。固定相采用聚酰胺薄膜，展開劑選用SDS-正丁醇-正庚烷-水組成的微乳液，使用CAMAG薄層色譜分析儀對數(shù)據(jù)及圖像進行處理，并構建METLC指紋圖譜。
　　4.HPLC檢測有效成分含量:使用Kromasil C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μ m），以1％冰醋酸-乙腈為流動相，采用梯度洗脫法，使

4、用DAD檢測器在350 nm波長處檢測綠原酸、木犀草苷的有效成分含量，并以此成分為研究對象構建HPLC指紋圖譜。
　　結果：
　　1.實驗篩選的16條ISSR引物和22對SRAP引物分別擴增出232、215條條帶，多態(tài)性條帶分別占到201、154條，得到的DNA指紋圖譜可清晰區(qū)別5種植物;UPGMA將5種忍冬屬植物聚為A、B兩大類，A類為金銀花基原植物，B類為山銀花基原植物，B類中，黃褐毛忍冬單獨聚為一支，其余種聚為一支;兩

5、種標記技術相關系數(shù)(r)為0.9703，呈顯著正相關性。
　　2.5種忍冬屬藥用植物rbcL基因序列長度在1143～1167 bp之間，手工校正后長度為1137 bp，保守位點1126個，變異位點11個，簡約信息位點6個;紅腺忍冬、灰氈毛忍冬和華南忍冬之間堿基序列幾乎相同，這三者與忍冬之間變異堿基有9個，與黃褐毛忍冬之間變異堿基有8個，忍冬與黃褐毛忍冬間變異堿基有5個。
　　3.METLC實驗確定出以含水量為75％的微乳液(

6、SDS-正丁醇-正庚烷-水=6.7∶15.8∶2.5∶75)-甲酸=9∶1為最佳展開劑，得到的斑點清晰、分離度好，數(shù)量多達12個，能有效的鑒別各藥材;以綠原酸和木犀草苷有效成分構建的METLC指紋圖譜可反應金銀花藥材與山銀花藥材在化學成分上的差異，并可區(qū)別山銀花藥材4種基原植物間化學成分的異同，5個樣品生成的指紋圖譜共有6條共有峰。
　　4.經(jīng)HPLC-DAD檢測，各樣品有效成分含量均達到《中國藥典》規(guī)定標準，木犀草苷成分僅在金銀

7、花中檢測出，綠原酸在金銀花和山銀花中均存在，其含量在灰氈毛忍冬中最高，在華南忍冬中最少;HPLC指紋圖譜共產(chǎn)生5個共有峰，從各樣品非共有峰可區(qū)別金銀花和山銀花藥材之間以及山銀花藥材4種基原植物間化學成分的差異。
　　結論：
　　ISSR和SRAP兩種分子標記有效揭示了忍冬屬藥材5種基原植物的多樣性水平，兩種標記形成的UPGMA聚類結果顯示，金銀花藥材基原植物忍冬與山銀花藥材的4種基原植物遺傳關系較遠，兩類藥材在基因水平上存在

8、一定差異。
　　5種植物的rbcL基因序列差異顯示，金銀花基原植物與山銀花基原植物間rbcL堿基序列存在差異，山銀花基原植物中黃褐毛忍冬與其余三個種差異較為明顯，以上結果與ISSR和SRAP分子標記中聚類結果一致。
　　METLC技術相比傳統(tǒng)TLC技術更加簡便、快速、經(jīng)濟，能有效鑒別金銀花藥材和山銀花藥材，并有效區(qū)別山銀花的4種基原植物，能夠應用于金銀花和山銀花藥材的質(zhì)量控制。
　　本課題綜合從分子水平以及化學成分水平