姜黃素對小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究.pdf

1、阿霉素(adriamycin，ADR)誘導(dǎo)的腎病被認(rèn)為與人類的微小病變及局灶階段性腎小球硬化(focalsegmentalglomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)及其相似。盡管阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型已廣泛應(yīng)用于實驗研究，但此模型在小鼠中成功的建立國內(nèi)還沒有見到報道。國外曾有報道阿霉素腎病小鼠有其獨特的優(yōu)越性，如成模時間快、經(jīng)濟(jì)易操作、更有益于遺傳學(xué)和免疫學(xué)研究等。ADR誘導(dǎo)的腎臟病理改變的機(jī)制目前還不清楚，雖然與對上皮細(xì)胞的直

2、接毒性效應(yīng)有關(guān)，但不可能是因為阿霉素毒性的慢性累積效應(yīng)造成的進(jìn)展性腎小球和腎間質(zhì)的損傷，因為阿霉素能夠迅速的被血液和腎臟清除掉。本課題擬建立小鼠阿霉素腎病模型，進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。 NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，一般情況下NF-κB是以P50-P65IκB結(jié)合成三聚體以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中。目前已發(fā)現(xiàn)它調(diào)節(jié)著100多種靶基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、生長因子、粘附分子等，多數(shù)均參與宿主的免疫和炎癥

3、反應(yīng)。這些因子對于免疫細(xì)胞的趨化、浸潤、活化、增生、分泌等有直接的調(diào)節(jié)作用。IκB是細(xì)胞內(nèi)NF-κB的主要抑制因子，細(xì)胞內(nèi)IκB的水平、IκB受信號刺激后能否正常磷酸化進(jìn)而降解對NF-κB活化起關(guān)鍵作用。在許多實驗性腎小球腎炎如抗腎小球基底膜腎炎、系膜增殖性腎小球腎炎、免疫復(fù)合物性腎小球腎炎等模型中均可見腎小球或腎皮質(zhì)中NF-κB活性的增加。但NF-κB活化在阿霉素腎病中的作用研究報道的較少。 姜黃素作為一個傳統(tǒng)的藥物已被廣泛用

4、于臨床治療，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎性疾病、動脈硬化、皮膚損傷、肝膽疾病等。目前姜黃素在治療腎臟疾病中已引起廣泛的重視。姜黃素能降低腎缺血再灌注和單側(cè)輸尿管阻塞模型大鼠血肌酐水平，抑制腎組織中RANTES、MCP-1，和同種移植物炎癥因子mRNA表達(dá)，從而減輕腎小管損傷及其間質(zhì)炎癥反應(yīng)，此外，姜黃素能延長皮膚移植物的存活時間，還可減少阿霉素腎病尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖酸苷酶、纖維連接蛋白、氨基葡糖多聚糖的含量，提示姜黃素具有潛在

5、的免疫抑制及腎臟保護(hù)作用。 本課題通過成功建立小鼠阿霉素腎病模型及體外培養(yǎng)細(xì)胞，動態(tài)觀察了NF-κB/IκB信號通路及受其調(diào)控的某些因子(本實驗只研究了MCP-1)及免疫炎性細(xì)胞的變化在阿霉素腎病發(fā)病中的作用以及姜黃素對阿霉素腎病的作用及機(jī)制，旨在進(jìn)一步為姜黃素在腎臟疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用提供有力的實驗依據(jù)。 第一部分小鼠阿霉素腎病的實驗研究 目的:為了更好的研究阿霉素腎病的發(fā)病機(jī)理，尋求建立一個穩(wěn)定性好、個體差異小與

6、人類腎病極其相似的動物模型。 方法:給予Balb/c小鼠尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg后觀察0、1、2、4、6、8周體重、尿蛋白、血清白蛋白、血甘油三酯、膽固醇、腎功能、外周血淋巴細(xì)胞及病理學(xué)改變以及腎組織中NF-κB活化、MCP-1的表達(dá)以及免疫炎性細(xì)胞的浸潤變化情況。 結(jié)果:小鼠慢性進(jìn)展性腎病模型復(fù)制成功。尿蛋白、血甘油三酯、膽固醇等隨著實驗的進(jìn)程明顯增高，而血清白蛋白、腎功能進(jìn)行性下降，腎臟病理由微小病變型發(fā)展

7、至腎小球硬化型，NF-κB異?；罨?、MCP-1表達(dá)增多，CD4+、CD8+T細(xì)胞逐漸增多、巨噬細(xì)胞逐漸減少。結(jié)論本實驗成功的建立了一個穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、個體差異小且與人類慢性腎病極其相似的小鼠阿霉素腎病模型，NF-κB異?；罨赡茉诎⒚顾啬I病發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。 第二部分姜黃素對小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究 實驗一姜黃素調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的實驗研究 目的:探討姜黃素對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其可能

8、機(jī)制。 方法:通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法研究姜黃素對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能的影響；用WesternBlot法檢測脾淋巴細(xì)胞胞核NF-κBp65蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:姜黃素能夠增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能；小劑量姜黃素能夠增加小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖；大劑量姜黃素能夠抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖；姜黃素能夠抑制脾淋巴細(xì)胞胞核NF-κBp65蛋白的表達(dá)。 結(jié)論:姜黃素具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，且與劑

9、量相關(guān)；可能的機(jī)制與抑制NF-κB活性有關(guān)。 實驗二姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及MCP-1表達(dá)的作用及其機(jī)制 目的:探討姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及MCP-1基因與蛋白表達(dá)的作用及其可能的機(jī)制。 方法:通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法研究姜黃素對阿霉素腎病小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生的影響；用RT-PCR、ELISA、Westernb

10、lot的方法檢測系膜細(xì)胞MCP-1mRNA的表達(dá)及其蛋白的分泌以及NF-κBP65的核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果:姜黃素能夠抑制阿霉素腎病小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生及NF-κBP65的核轉(zhuǎn)位，從而減少系膜細(xì)胞MCP-1mRNA的表達(dá)及其蛋白的分泌。 結(jié)論:姜黃素抑制阿霉素腎病小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，其機(jī)制可能與抑制NF-κB/IκB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 實驗三姜黃素對

11、小鼠阿霉素腎病作用的實驗研究 目的:探討姜黃素對小鼠阿霉素腎病的作用及其可能的作用機(jī)制。 方法:給予Balb/c小鼠尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg，1w后給予姜黃素灌胃，分別于注射阿霉素后1w、2w、4w、6w、8w動態(tài)觀察及用RT-PCR、IHC、Westernblot方法檢測MCP-1、NF-κB、IκBα、IκBβ、免疫細(xì)胞等的表達(dá)。 結(jié)果:小鼠腎組織呈慢性進(jìn)展性損傷，腎組織中NF-κB活性顯著增強(qiáng)，M