棉花幼苗葉片中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶響應(yīng)鹽脅迫的分析.pdf

1、土地鹽堿化作為一種非生物脅迫，已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要限制因素。棉花作為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)高溫、干旱、高鹽等非生物脅迫具有一定耐性，但鹽濃度過(guò)高會(huì)造成棉花滲透脅迫和離子毒害，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione transferases，GSTs，EC2.5.1.18）是一類多功能蛋白家族，在植物體抵御外源物質(zhì)毒害及抵抗多種非生物脅迫中起著重要作用。目前，對(duì)GST在耐鹽方面的研究多集中在煙草、擬南芥

2、等模式生物中，但是對(duì)棉花中GST的耐鹽機(jī)理研究還鮮有報(bào)道。
　　本研究首先利用生物信息學(xué)方法，對(duì)棉花谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位、三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行了同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在此基礎(chǔ)上以中棉所79為實(shí)驗(yàn)材料，利用NaCl溶液模擬鹽脅迫對(duì)棉花葉片中GST的表達(dá)進(jìn)行分析。對(duì)基于SDS-PAGE的western blot檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，確定了適合western blot的最佳蛋白樣品制備方

3、法和電泳上樣量，對(duì)鹽脅迫下棉花GST的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，建立了基于雙向電泳的western blot分析方法，得到了鹽脅迫下棉花GST的差異表達(dá)圖譜，并對(duì)western blot檢測(cè)出的GST差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行量化分析，獲得棉花GST亞型響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下：
　　1、對(duì)棉花中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用多種工具在理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、親水性/疏水性方面進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示 GST含有

4、225個(gè)氨基酸，分子量為26KDa，等電點(diǎn)為5.75，屬于親水性蛋白質(zhì)，蛋白性質(zhì)穩(wěn)定為細(xì)胞質(zhì)蛋白。利用Blastp進(jìn)行同原序列比對(duì)，選擇6條氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　2、優(yōu)化了棉花葉片蛋白的制備方法并確定適用于western blot的上樣量。在參考本實(shí)驗(yàn)室已有的提取方法及查找文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，篩選適合于1D-western blot檢測(cè)GST的最適樣品制備方法，最終確定了提取蛋白粉溶解上樣的方法。通過(guò)不同上樣量的western

5、 blot顯影效果，發(fā)現(xiàn)GST適合于較高的上樣量。3、利用SDS-PAGE和western blot方法對(duì)鹽脅迫下的棉花谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量的變化進(jìn)行分析。在鹽濃度相同的條件下，不同的脅迫時(shí)間造成棉花葉片中GST的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，對(duì)照組棉花葉片內(nèi)GST表達(dá)穩(wěn)定，鹽脅迫12小時(shí)后GST的表達(dá)受到抑制，處理24小時(shí)GST的表達(dá)量開(kāi)始上升，并隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而不斷上升。
　　4、建立了基于雙向電泳技術(shù)的western blot檢測(cè)體系

6、。對(duì)脅迫24h的棉花幼苗葉片蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，獲得棉花葉片響應(yīng)鹽脅迫的差異蛋白圖譜。在此基礎(chǔ)上對(duì)蛋白凝膠經(jīng)行western blot分析得到2D-western blot的差異蛋白點(diǎn)，利用ImageMaster2D PLatinum7軟件對(duì)不同的GST蛋白點(diǎn)進(jìn)行匹配和量化分析。結(jié)果顯示，棉花中共有8個(gè)GST蛋白點(diǎn)響應(yīng)鹽脅迫，并出現(xiàn)差異表達(dá)，其中2個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。這表明，棉花葉片中存在多種亞型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，且在鹽脅迫