家兔發(fā)熱誘導(dǎo)的HSF1聚合對(duì)體溫及下丘腦cAMP含量的影響.pdf

1、熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor，HSF)是一組結(jié)構(gòu)和功能具有廣泛同源性，普遍存在于真核生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，其中HSF1在多種應(yīng)激原刺激下，由無(wú)活性的單體形態(tài)向有活性的三聚體轉(zhuǎn)化，特別是熱刺激可直接激活HSF1。 一般情況下，機(jī)體在炎癥性發(fā)熱時(shí)，體溫升高大多數(shù)不超過(guò)41℃，這種現(xiàn)象稱為熱限(fever limit)，提示體內(nèi)存在調(diào)控體溫的自限系統(tǒng)。本研究室以往的研究結(jié)果顯示HSF1具

2、有降低外周內(nèi)生性致熱原產(chǎn)生的作用，進(jìn)而限制體溫的升高。但是HSF1是否參與了發(fā)熱時(shí)中樞體溫調(diào)控過(guò)程及可能的作用機(jī)制還不清楚。 本研究旨在進(jìn)一步探討HSF1在發(fā)熱時(shí)參與體溫調(diào)控作用的中樞機(jī)制，應(yīng)用脂多糖(LPS)復(fù)制家兔發(fā)熱模型，觀察發(fā)熱不同時(shí)相下丘腦組織中HSF1的聚合與cAMP含量變化的時(shí)相關(guān)系；同時(shí)通過(guò)給予槲皮素(quercetin，QCT又稱2-(3，4)-3，5,7-五羥黃酮)抑制HSF1的活化，進(jìn)一步觀察LPS致發(fā)熱過(guò)

3、程及下丘腦組織中HSF1和HSP70的表達(dá)與cAMP含量的變化。 實(shí)驗(yàn)方法 1、動(dòng)物分組及模型制備新西蘭健康雄性家兔70只，隨機(jī)分成4組，第Ⅰ組是對(duì)照組(N)(5只)，向側(cè)腦室注入無(wú)水乙醇40μl，10min后經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水1ml/Kg；第Ⅱ組是槲皮素組(Q)(5只)，向側(cè)腦室注入槲皮素(2.5μmol/L)40μl，10min后經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水1ml/Kg：第Ⅲ組是LPS組(L)(30只，分6個(gè)采樣點(diǎn))，

4、向側(cè)腦室注入無(wú)水乙醇40μl，10mm后經(jīng)耳緣靜脈注射0.5gμg/ml的LPSlml/Kg；第Ⅳ組是槲皮素+LPS組(Q+L)(30只，分6個(gè)采樣點(diǎn))，向側(cè)腦室注入槲皮素40μl，10min后經(jīng)耳緣靜脈注射LPS。 2、體溫測(cè)定使用SN-2202型數(shù)字溫度計(jì)測(cè)量體溫。在實(shí)驗(yàn)前三天，每天讓動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3小時(shí)。家兔放在特制的兔箱內(nèi)，將溫度計(jì)探頭插入直腸內(nèi)10cm并固定于尾根部，待體溫穩(wěn)定后每間隔15min記錄一次體溫，取三

5、次的平均值作為基礎(chǔ)體溫。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔10min記錄一次體溫，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。測(cè)定即時(shí)體溫與基礎(chǔ)體溫之差(△T/℃)，最大體溫變化值(△T<,max>/℃)及體溫反應(yīng)指數(shù)(thermal response index，TRI，為體溫曲線與時(shí)間軸的面積積分)。 3、樣品采集及檢測(cè)第Ⅰ、Ⅱ組經(jīng)耳緣靜脈注射生理鹽水后在180min時(shí)取下丘腦組織；第Ⅲ、Ⅳ組經(jīng)耳緣靜脈注射LPS后分別在0、30、60、180、240、360min時(shí)取下丘腦

6、組織，立即投入液氮中速凍固定，20min后存放于-70℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。樣品cAMP含量的測(cè)定用放射免疫的方法；HSF1和HSP70表達(dá)量的檢測(cè)用Western blot的方法。用電泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500)通過(guò)Flour Chen V2.0分析軟件測(cè)定各組蛋白質(zhì)帶的IDV值，作為HSF1和HSP70的相對(duì)含量。 4、統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS11.0軟件進(jìn)

7、行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行兩因素方差分析，相關(guān)分析用相關(guān)性檢驗(yàn)分析法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、各實(shí)驗(yàn)組家兔的體溫變化槲皮素組與對(duì)照組比較各時(shí)間點(diǎn)的△T無(wú)明顯差異(P>0.05)。給家兔靜脈注射L,PS可引起雙峰熱，注射LPS后60min時(shí)家兔體溫上升達(dá)第一個(gè)高峰(1.32±0.17℃)，之后略有回降，在注射后180min時(shí)，體溫上升達(dá)第二個(gè)高峰(1.84±0.15℃)，第二峰高于第一峰，在360min左右回降至接近

8、基礎(chǔ)水平。LPS組與對(duì)照組比較，在60～300min期間，△T差異非常顯著(P<0.01)。槲皮素+LPS組的體溫變化也呈雙峰熱，與對(duì)照組比較，在60～360min期間，△T差異非常顯著(P<0.01)；與LPS組比較，發(fā)熱時(shí)程延長(zhǎng)，發(fā)熱幅度升高，在240min～360min期間，△T差異顯著(P<0.01)；6h體溫反應(yīng)指數(shù)(TRI<,6>)也顯著高于LPS組(P<0.01)。 2、下丘腦組織cAMP含量的變化在LPS組，下丘

9、腦中cAMP的含量在注射LPS后60min開(kāi)始升高，180min達(dá)到高峰，360min時(shí)回降至基礎(chǔ)水平，在60min、180min及240min組cAMP的含量與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)；槲皮素+LPS組各時(shí)間點(diǎn)的cAMP含量與LPS組比較明顯增加(P<0.01)。cAMP含量的變化與體溫的變化呈正相關(guān)(r=0.890，P<0.01)。 3、下丘腦組織HSF1表達(dá)量的變化在LPS組和槲皮素+LPS組，下丘腦組織中HSF

10、1的總表達(dá)量(包括三聚體和單體)在實(shí)驗(yàn)觀察期間無(wú)明顯變化(P>0.05)；而HSF1三聚體表達(dá)量在體溫處于高峰值時(shí)(180min)明顯增加，之后，HSF1三聚體表達(dá)量仍繼續(xù)增多，體溫逐漸下降。槲皮素+LPS組的HSF1三聚體的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)應(yīng)的LPS組(P<0.05)。 4、下丘腦組織HSF1三聚體表達(dá)量與體溫及cAMP含量變化的相關(guān)分析LPS致發(fā)熱過(guò)程中，在達(dá)到體溫高峰以后(180～360 min)，下丘腦中HSF1

11、三聚體的含量與體溫的變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.897，P<0.01)：與cAMP的含量變化之間也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.807，P<0.01)。 5、下丘腦組織HSP70表達(dá)的變化在下丘腦組織中HSP70的表達(dá)水平在給予LPS后180min時(shí)達(dá)高峰值，且槲皮素+LPS組各時(shí)間點(diǎn)HSP70的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的LPS組，進(jìn)一步證實(shí)槲皮素抑制HSF1激活的作用。 小結(jié)： 1、家兔靜脈注射LPS可引起雙峰熱，且第二峰高于第一峰

12、。腦室內(nèi)給予槲皮素，增強(qiáng)了LPS的致熱效果，使發(fā)熱幅度升高，發(fā)熱時(shí)程延長(zhǎng)。 2、在LPS致發(fā)熱過(guò)程中，下丘腦中cAMP含量的變化與體溫的變化呈正相關(guān)。 3、在LPS致發(fā)熱過(guò)程中，下丘腦中HSF1的總含量(包括三聚體和單體)無(wú)明顯變化，而三聚體的含量逐漸增加，體溫達(dá)最高值后HSF1三聚體含量與體溫的變化呈負(fù)相關(guān)。 4、在LPS致發(fā)熱過(guò)程中，體溫達(dá)最高值后HSF1三聚體含量與下丘腦中cAMP含量的變化呈負(fù)相關(guān)。