HSF1在LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱過程中參與調(diào)節(jié)PO-AH區(qū)TRPV1基因的表達(dá).pdf

1、目的：
　　機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)功能對(duì)于生命活動(dòng)是非常重要的。當(dāng)機(jī)體在感染等情況下會(huì)引起發(fā)熱反應(yīng)，即出現(xiàn)調(diào)節(jié)性體溫升高。體溫升高將影響到機(jī)體的許多正常功能活動(dòng)，但是在一般情況下人體這種調(diào)節(jié)性的體溫升高不會(huì)超過42℃，這說明體內(nèi)存在著限制體溫過高的調(diào)節(jié)機(jī)制。然而，關(guān)于體溫調(diào)節(jié)中樞監(jiān)測(cè)及調(diào)控體溫的分子機(jī)制還不清楚。
　　瞬時(shí)感受器電位1(TRPV1)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有溫度感受特性的TRP家族成員之一，是一種主要允許Ca2+通透的陽離子

2、通道。在體外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TRPV1可感受高于43℃的熱刺激，辣椒素及某些內(nèi)源性介質(zhì)能夠激活此通道。隨后，人們?cè)谀X內(nèi)多個(gè)部位發(fā)現(xiàn)了TRPV1的存在，其中包括重要的體溫調(diào)節(jié)中樞視前區(qū)-下丘腦前部(PO/AH)。根據(jù)TRPV1感受的溫度范圍特點(diǎn)，提示PO/AH區(qū)的TRPV1可能參與機(jī)體發(fā)熱時(shí)體溫調(diào)控過程。但是，TRPV1作為體溫調(diào)節(jié)的元件，調(diào)控其表達(dá)的分子機(jī)制還不清楚。
　　熱休克反應(yīng)(HSR)是生物體在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激狀態(tài)下表現(xiàn)的

3、以基因表達(dá)變化為特征的防御適應(yīng)反應(yīng)，在生物體中普遍存在，參與廣泛的細(xì)胞機(jī)能的調(diào)節(jié)，具有重要的生物學(xué)作用。這一反應(yīng)主要通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（HSF1）在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)。HSF1已被公認(rèn)為是機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體對(duì)抗多種應(yīng)激刺激中起重要作用。
　　關(guān)于HSF1是否參與TRPV1對(duì)體溫的調(diào)節(jié)作用目前尚無報(bào)道。我們推測(cè)存在于體溫調(diào)節(jié)中樞PO/AH的TRPV1的表達(dá)可能受HSF1的調(diào)控，為此，我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析了

4、TRPV1基因上游啟動(dòng)子-2133bp的區(qū)域有無HSF1的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了有3處HSF1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　為進(jìn)一步明確發(fā)熱時(shí)中樞體溫調(diào)節(jié)的分子生物學(xué)機(jī)制，本研究采用LPS致大鼠發(fā)熱模型及培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(PC12)，探討了HSF1是否在LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱過程中參與調(diào)控TRPV1基因的表達(dá)，并尋找在TRPV1基因上游啟動(dòng)子中HSF1的結(jié)合位點(diǎn)。
　　材料與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤

5、細(xì)胞（PC-12）在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，飽和濕度、37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染和雙熒光分析。
　　2、基因組DNA提取及目的DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)
　　應(yīng)用蛋白酶K降解和連續(xù)的酚-氯仿萃取法提取大鼠PO/AH區(qū)細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA。應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到6個(gè)近端位點(diǎn)相同，遠(yuǎn)端位點(diǎn)不同的TRPV1DNA片段，以翻譯起始點(diǎn)ATG定位為-1，遠(yuǎn)端位點(diǎn)分別定位于-2123、-1425、-1160、

6、-821、-394和-254。PCR反應(yīng)中在這6條DNA片段的上、下游分別連接BglⅡ和MulⅠ限制性酶切位點(diǎn)。
　　3、將上述目的DNA片段克隆至pGL3增強(qiáng)型熒光報(bào)告基因質(zhì)粒
　　首先將上述目的DNA片段克隆至pMD18-T simple質(zhì)粒中，應(yīng)用BglⅡ和MulⅠ雙酶切及測(cè)序反應(yīng)鑒定其長(zhǎng)度是否準(zhǔn)確，并進(jìn)行堿基序列分析。應(yīng)用BglⅡ和MulⅠ雙酶切pMD18-T simple質(zhì)粒，回收目的DNA，應(yīng)用T4DNA連接酶將

7、目的DNA序列克隆至pGL3增強(qiáng)型熒光報(bào)告基因質(zhì)粒。
　　4、突變熒光報(bào)告基因質(zhì)粒的制備
　　以pTRPV1/-1160熒光報(bào)告基因質(zhì)粒作為模板，在HSE1元件中按照試劑盒說明書(Stratagene，La Jolla，CA)將堿基G突變成堿基T。
　　5、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與活性檢測(cè)
　　應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒海腎熒光素酶(pRL-TK，內(nèi)對(duì)照)轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)

8、胞中。43℃熱處理15min，37℃培養(yǎng)4h后應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢光素酶活性。
　　6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　(1)對(duì)照組，向SPF級(jí)SD大鼠(license：SCXK(Liaoning)2008-0005)腹腔注射1mL生理鹽水(n=12)。LPS組，向大鼠腹腔注射1mL LPS(80μg/kg，應(yīng)用無菌生理鹽水稀釋，n=48)。
　　(2)PO/AH區(qū)樣品的采集：對(duì)照組在注射生理鹽水4h后采集，LPS組的樣品

9、采集分別在LPS注射后0h，2h，3h，4h和5h。
　　7、生物信號(hào)遙感術(shù)測(cè)量體溫
　　應(yīng)用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，通過腹正中切口向腹腔內(nèi)植入發(fā)射子(model TA-F40，Respironics-Mini Mitter,Bend，OR)并將其固定在腹壁上，關(guān)閉腹腔，恢復(fù)7天。應(yīng)用BW-200生理無線遙測(cè)系統(tǒng)(Chengdu Technology and Market Corp.，LTD)測(cè)量基礎(chǔ)體溫

10、和給藥后的實(shí)時(shí)體溫。
　　8、電泳遷移率分析(EMSA)檢測(cè)HSF1與TRPV1基因啟動(dòng)子的結(jié)合
　　首先應(yīng)用Thermo scientific公司的Biotin3'End DNA Labeling Kit標(biāo)記含有HSE1反應(yīng)元件的雙鏈DNA探針。然后與反應(yīng)液混勻后室溫孵育20min。孵育結(jié)束后，每20μ1反應(yīng)液中加入5μl5X Loading Buffer后混勻。樣品應(yīng)用4％預(yù)電泳的非變性聚丙烯凝膠分離，并檢測(cè)樣品的遷移狀

11、況。
　　結(jié)果：
　　1、克隆6條5'系列截短的大鼠TRPV1基因啟動(dòng)子序列
　　以大鼠PO/AH區(qū)基因組DNA為模板，克隆6條近端位點(diǎn)相同，遠(yuǎn)端位點(diǎn)分別位于-2123、-1425、-1160、-821、-394和-254(以翻譯起始點(diǎn)ATG密碼子定位為-1)的TRPV1DNA片段，并且這些片段的上、下游分別含有BgiⅡ和MulⅠ限制性酶切位點(diǎn)。
　　2、構(gòu)建含有6條5'端系列截短的大鼠TRPV1基因啟動(dòng)子序列熒

12、光報(bào)告基因
　　將上述6條5'端逐漸截短的DNA片段連接到pMD18-T simple質(zhì)粒中。應(yīng)用T4DNA連接酶將目的DNA序列克隆至pGL3增強(qiáng)型熒光報(bào)告基因質(zhì)粒。
　　3、構(gòu)建大鼠突變型TRPV1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因
　　以pTRPV1/-1160熒光報(bào)告基因質(zhì)粒作為模板，按照定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f明書(Stratagene，La Jolla，CA)在HSE1元件中將堿基G突變成堿基T。
　　4、大鼠TRPV1報(bào)告

13、基因活性的檢測(cè)
　　(1)6個(gè)TRPV1基因啟動(dòng)子的5'端突變體片段，分別轉(zhuǎn)染至PC-12細(xì)胞中，通過43℃、15min熱應(yīng)激處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了包含pTRPV1/-2123、pTRPV1/-1425和pTRPV1/-1160片段質(zhì)粒的細(xì)胞加熱后轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，且三者之間沒有明顯的差異;而轉(zhuǎn)染了包含pTRPV1/-821、pTRPV1/-394和pTRPV1/-254片段質(zhì)粒的細(xì)胞加溫后未檢測(cè)到明顯的轉(zhuǎn)錄活性。
　　(2)分別

14、將含有野生型HSE1(con.HSE)和含有突變型HSE1(mut.HSE)結(jié)構(gòu)的pTRPV/-1160轉(zhuǎn)染至PC-12細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞給予上述的熱應(yīng)激處理后檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。
　　結(jié)果顯示，HSE1序列中G到T的突變完全阻斷了加熱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。
　　5、LPS致熱大鼠體溫變化
　　與對(duì)照組比較，大鼠注射LPS后體溫逐漸升高，在4h時(shí)出現(xiàn)發(fā)熱高峰，AT為1.38±0.19℃(n=12，P＜0.01)，之后體溫呈下降

15、趨勢(shì)。
　　6、LPS致熱大鼠PO/AH區(qū)TRPV1的表達(dá)
　　在LPS誘導(dǎo)發(fā)熱時(shí)，大鼠PO/AH區(qū)細(xì)胞TRPV1表達(dá)水平隨著體溫的升高明顯升高，并在LPS處理4h時(shí)達(dá)到高峰。此后，隨著體溫的降低而下降，這一變化與大鼠的體溫變化呈正相關(guān)（Y=1.298+4.410X，R=0.8047）。
　　7、LPS致熱大鼠PO/AH區(qū)細(xì)胞HSF1活性
　　(1)采用Western-blot方法，檢測(cè)了核內(nèi)HSF1的表達(dá)量。<

16、br>　　結(jié)果顯示，核內(nèi)HSF1的表達(dá)隨體溫的升高而逐漸增加，在LPS處理4h組HSF1的表達(dá)量升高最明顯。此后，體溫下降，HSF1的表達(dá)下調(diào)，這一變化與大鼠的體溫呈正相關(guān)(Y=0.5892+0.2703X,R=0.8435)
　　(2)采用細(xì)胞核染色和HSF1免疫熒光染色，分析了LPS誘導(dǎo)發(fā)熱過程中PO/AH細(xì)胞HSF1的亞細(xì)胞定位特征。
　　結(jié)果顯示，在對(duì)照組中HSF1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而LPS處理4h后，大量HSF1轉(zhuǎn)

17、移至細(xì)胞核中。
　　8、在LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱時(shí)大鼠PO/AH區(qū)細(xì)胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表達(dá)水平在體溫升高時(shí)都相應(yīng)的增加，二者之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(Y=0.5608X+0.1586,R=0.8919)
　　結(jié)論：
　　1、LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱時(shí)，TRPV1的表達(dá)水平上調(diào)，并且與體溫升高水平呈正相關(guān)。
　　2、LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱時(shí)，HSF1的表達(dá)水平上調(diào)，與體溫升高水平呈正相關(guān)，并且由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移。<

18、br>　　3、在LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱時(shí)大鼠PO/AH區(qū)細(xì)胞中的TRPV1蛋白和HSF1蛋白的表達(dá)水平在體溫升高時(shí)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(Y=0.5608X+0.1586，R=0.8919)
　　4、在PC12細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型TRPV1啟動(dòng)子報(bào)告基因，通過熱應(yīng)激刺激，顯示TRPV1啟動(dòng)子中的HSE1序列是誘導(dǎo)TRPV1基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵元件，并證實(shí)HSE1位于TRPV1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-919～-910區(qū)域。
　　5、在LPS