低氧高二氧化碳對人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌低氧誘導(dǎo)因子、內(nèi)皮素、前列環(huán)素的影響及中藥的保護(hù)研究.pdf

1、背景：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其肺功能常呈進(jìn)行性減退，通氣和換氣功能障礙可導(dǎo)致缺氧和二氧化碳潴留，發(fā)生不同程度的低氧血癥和高碳酸血癥，引起進(jìn)行性的肺動脈高壓[1]。在肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制及治療方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞起著極為重要的作用。國內(nèi)外多項研究表明，缺氧可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間距增大，血管通透性增高;缺氧可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損，不但加重了組織細(xì)胞的缺氧，還使得炎癥細(xì)胞過多聚集于局部組織，直

2、接造成組織細(xì)胞損傷;缺氧還可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)出現(xiàn)平衡失調(diào)，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)受損及凝血異常等。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是PH的起始環(huán)節(jié)，而肺血管收縮增強(qiáng)和肺血管結(jié)構(gòu)重建被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞受損后出現(xiàn)的主要血管變化特征。上述因素單獨(dú)或相互作用，導(dǎo)致肺動脈高壓進(jìn)一步加重。而肺動脈高壓一旦形成，肺心病就可能接踵而至。近年來對低氧反應(yīng)通路的研究越來越深入，目前所發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)機(jī)體和局部組織缺氧反應(yīng)最關(guān)鍵的特異性中介因子之一的低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1

3、α)，廣泛參與哺乳動物細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)的特異應(yīng)答，是低氧條件下高表達(dá)的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，在低氧性肺損傷中具有重要作用[2]。HIF-1α是一個異源二聚體，由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達(dá)的β亞基組成。HIF-1α的表達(dá)直接與細(xì)胞內(nèi)氧分壓有關(guān)，常氧下HIF-1α迅速降解，而在低氧環(huán)境下HIF-1α蛋白迅速積累，可呈指數(shù)形式增高，并啟動了多種低氧適應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，如內(nèi)皮素-1(ET-1)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。在這些基因的啟動子、增強(qiáng)子或

4、其他調(diào)控區(qū)域均含有HIF-1α的特異結(jié)合序列。在肺代謝中，內(nèi)皮素是目前已知作用最強(qiáng)、持續(xù)最久的縮血管活性多肽，它具有收縮血管、促進(jìn)生長因子和粘連分子的釋放和表達(dá)、刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和纖維連接蛋白的產(chǎn)生等多種生物學(xué)作用，它不僅參與血管的張力調(diào)節(jié)，而且參與低氧條件下的肺動脈重構(gòu)，在肺動脈高壓的形成中具有重要的調(diào)節(jié)作用。國內(nèi)外動物研究發(fā)現(xiàn)[3]，當(dāng)暴露于低氧高二氧化碳環(huán)境（模擬COPD環(huán)境）下，大鼠血漿ET-1濃度較正常對照組明顯升高，原位雜

5、交發(fā)現(xiàn)，慢性低氧高二氧化碳組大鼠肺動脈ET-1mRNA表達(dá)較正常對照組明顯增強(qiáng)。因此推測肺動脈ET-1的合成分泌增多可能為慢性低氧高二氧化碳引起肺動脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重建的重要原因。前列環(huán)素(PGI2)主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，具有強(qiáng)大的擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集及細(xì)胞黏附的作用，因此PGI2不僅能預(yù)防血栓形成，還能直接作用于平滑肌細(xì)胞，進(jìn)而促使血管擴(kuò)張;此外，它還能拮抗內(nèi)皮素的生成和分泌，抑制血小板聚集，抑制細(xì)胞的移行和增殖作用。低氧高二氧化

6、碳環(huán)境可以引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致其分泌的血管活性物質(zhì)失衡，最終促進(jìn)肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展。因此，應(yīng)用藥物或其他干預(yù)因素改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，在低氧性肺動脈高壓治療中起著重要的作用。目前在調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞功能方面，主要有以下方面的進(jìn)展：ET受體拮抗劑，目前此藥在肺動脈高壓的治療中已取得較好的臨床療效，它使得人們從簡單的擴(kuò)肺血管治療轉(zhuǎn)移到控制肺血管重塑上；一氧化氮(NO)及其前體，可減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及擴(kuò)張血管平滑肌細(xì)胞；前列環(huán)素類藥物，

7、增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的濃度，直接發(fā)揮擴(kuò)血管作用，并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，可改善NO介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物；鈣離子拮抗劑，可增強(qiáng)NO舒張平滑肌的作用，抑制ET-1的縮血管作用，并有一定抗氧化作用，可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能；中醫(yī)中藥，其中川芎、丹參、漢防已甲素等，已有動物實驗證明均存在減輕缺氧性肺動脈高壓中血管內(nèi)皮損傷的作用；內(nèi)皮祖細(xì)胞種植和基因治療?？傊S著對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在肺動脈高壓形成中

8、地位認(rèn)識的不斷提高，保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能已成為治療肺動脈高壓的重要目標(biāo)之一。益肺活血復(fù)方制劑(YFHXC)是我國著名中醫(yī)內(nèi)科學(xué)家董建華院士多年來治療肺心病的經(jīng)驗性中藥復(fù)方，其療效經(jīng)多年臨床實踐已得到證實。既往研究表明，在動物實驗水平上，YFHXC可抑制肺血管中膜增厚、減輕血管縮窄、降低肺動脈高壓[4-5];在細(xì)胞水平上YFHXC可以抑制體外低氧下培養(yǎng)的大鼠平滑肌增殖及促進(jìn)NO生成。而COPD患者常常在肺泡低氧的同時伴有二氧化碳潴留，而

9、且二氧化碳潴留在肺動脈高壓形成中起著一定的作用。因此我們實驗中采用低氧高二氧化碳條件來作用于人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs），并觀察此條件下HPAECs形態(tài)、內(nèi)分泌功能的變化及YFHXC對HPAECs的作用。
　　 目的：研究低氧高二氧化碳對人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌HIF-1α、ET-1和PGI2的影響及益肺活血復(fù)方制劑的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：⑴制備益肺活血復(fù)方制劑:生藥的原材料由北京市衛(wèi)生局臨床藥物研究所鑒定審核，制作方

10、法:把生藥原材料放入重蒸水煎沸，每次3小時，合并2次濾液，4000r/min離心15min后取上清液，濃縮，制成益肺活血復(fù)方制劑，濃縮至含生藥1g/ml濃度。⑵制備含藥血清:選擇新西蘭大耳白兔20只，隨機(jī)分為4組:生理鹽水組，益肺活血復(fù)方制劑低濃度組、益肺活血復(fù)方制劑中濃度組、益肺活血復(fù)方制劑高濃度組（分別為生藥10、20、40g/kg），每組5只。采用血清藥理學(xué)方法，各組分別以生理鹽水和低、中、高濃度益肺活血復(fù)方連續(xù)灌胃7天，每天兩次

11、（灌胃前禁食不禁水12小時）。末次灌胃給藥2小時后，腹主動脈無菌采血，室溫靜置2小時，離心后分離血清，合并同組含藥血清，56℃滅活30分鐘，用0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩＂遣捎觅N壁法培養(yǎng)HPAECs:將HPAECs細(xì)胞株復(fù)蘇，每隔一天更換培養(yǎng)液一次，待瓶底覆蓋約80％，以胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，選用生長良好的3～5代細(xì)胞進(jìn)行試驗。HPAECs隨機(jī)分為空白對照組、模型組、低氧高二氧化碳+益肺活血復(fù)方制劑含藥血清低、中、

12、高濃度組。⑷親和素-生物素復(fù)合體法(SABC)測定HIF-1α蛋白含量:將細(xì)胞以4×104/孔接種于6孔板中制作細(xì)胞爬片，用PBS洗每個孔兩次，加4％多聚甲醛固定30min，再用PBS洗3次，3％雙氧水及血清室溫封閉20min;依次滴加一抗、生物素化二抗、試劑SABC，最后采用DAB試劑顯色。⑸放射免疫分析法測定細(xì)胞上清液中的ET-1:將細(xì)胞以4×104/孔接種于6孔板中，各組細(xì)胞按試驗分組處理12小時后，收取各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，置于-

13、20℃冰箱儲存?zhèn)錅y。⑹放射免疫分析法測定細(xì)胞上清液中PGI2:按照以上方法接種細(xì)胞，各組細(xì)胞按試驗分組處理12小時后，收取各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，置于-20℃冰箱儲存?zhèn)錅y。⑺RT-PCR法測定ET-1mRNA表達(dá):按照以上方法準(zhǔn)備細(xì)胞，各組細(xì)胞按試驗分組處理12小時后，收集各組細(xì)胞。按照總RNA提取試劑盒提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA濃度，A260/A280=1.8～2.0，可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;用瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整度。取

14、1ugRNA按照逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒說明合成cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng);PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。⑻所有數(shù)據(jù)用均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S）表示。用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間多重比較用LSD檢驗。其中P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①空白對照組細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)幾乎未表達(dá)HIF-1α蛋白，模型組細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)較空白對照組明

15、顯增多(n=6，P＜0.01);低、中、高濃度益肺活血復(fù)方制劑含藥血清組與模型組相比，低濃度組細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)較模型組無明顯變化(n=6，P＞0.05);而中、高濃度含藥血清組細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)較模型組顯著降低，且有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，P＜0.05)。②空白對照組細(xì)胞可分泌一定量的ET-1，模型組分泌的ET-1明顯高于空白對照組(P＜0.01);與模型組相比，低濃度益肺活血復(fù)方制劑含藥血清組分泌的ET-1含量較模

16、型組無明顯變化(P＞0.05)，而中、高濃度含藥血清組細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的ET-1含量較模型組明顯減少，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。③模型組分泌的PGI2明顯低于空白對照組(P＜0.01)，與模型組相比，低濃度益肺活血復(fù)方含藥血清組分泌的PGI2含量較模型組無明顯變化(P＞0.05)，而中、高濃度含藥血清組細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的PGI2含量較模型組明顯增多，且結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。④空白對照組細(xì)胞表達(dá)較少量的ET-

17、1mRNA，模型組細(xì)胞ET-1mRNA的表達(dá)顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，P＜0.05);低、中、高益肺活血復(fù)方制劑含藥血清組與模型組相比，低濃度含藥血清組的表達(dá)較模型組無明顯變化;中、高濃度含藥血清組細(xì)胞內(nèi)ET-1 mRNA的表達(dá)較模型組明顯減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：低氧高二氧化碳環(huán)境下HPAECs核內(nèi)HIF-1α蛋白、ET-1mRNA的表達(dá)及其分泌的ET-1增多，但HPAECs分泌的PGI2減少。