HSP70介導腎臟缺血預適應保護作用的實驗研究.pdf

1、缺血再灌注損傷導致的急性腎功能衰竭(Acuterenalfailure,ARF)發(fā)生率很高，最近有關(guān)缺血預適應(IschemiaPreconditioning，IP)預防缺血再灌注損傷的研究日益增多。器官短暫缺血/再灌注后能耐受更長時間缺血的現(xiàn)象稱為IP。IP現(xiàn)象最先發(fā)現(xiàn)于心臟，以后發(fā)現(xiàn)腎臟也存在缺血預適應現(xiàn)象。缺血預適應的機制尚未完全清楚。文獻報道，腎臟在缺血預適應后，熱休克蛋白70(Heatshockproteins，HSP70)的

2、表達升高，HSP70的高表達是否參與IP保護腎臟缺血再灌注損傷的機理，國內(nèi)外未見報道。本課題擬運用腺相關(guān)病毒為真核表達載體制備含HSP70基因的重組腺相關(guān)病毒載體，進行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實驗，證明HSP70在腎臟缺血預適應中是否介導保護作用。 目的：通過體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實驗研究AAV-HSP70基因轉(zhuǎn)染介導腎小管上皮細胞抗氧化損傷的保護作用及在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中介導的保護作用，探討HSP70在腎臟缺血預適應中介導的保護作用機理。缺血預適

3、應機制的深入研究對腎臟缺血再灌注損傷的防護及延長移植腎的存活時間有重要意義。 方法：第一部分：AAV-HSP70的構(gòu)建及表達1.RT-PCR法從人肝癌細胞系HepG2中克隆HSP70基因，獲得序列完全正確的全長HSP70cDNA。 2.用已克隆的正確序列HSP70基因片斷，構(gòu)建腺相關(guān)病毒重組體pAAV-IRES-hrGFP/HSP70，將此質(zhì)粒擴增、提純后與pAAV-Helper、pAAV-RC共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，

4、通過同源重組獲得AAV-HSP70重組體，擴增后獲得高滴度的AAV-HSP70病毒液。 第二部分：AAV-HSP70轉(zhuǎn)染對腎小管上皮細胞抗氧化氧損傷的保護作用將AAV-HSP70體外轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞，通過免疫組化法檢測目的基因在轉(zhuǎn)染細胞中的表達，通過MTT法及51Cr釋放試驗檢測在不同濃度的H2O2作用下HSP70的保護作用。 第三部分：AAV-HSP70轉(zhuǎn)染對大鼠缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究1.建立大鼠

5、腎缺血再灌注損傷模型及缺血預適應模型，檢測HSP70的表達；62.將獲得的高滴度的AAV-HSP70病毒液通過靜脈注射轉(zhuǎn)染大鼠，檢測正常大鼠、轉(zhuǎn)基因大鼠及大鼠缺血預適應后HSP70在大鼠腎臟的表達；觀察AAV-HSP70轉(zhuǎn)染介導缺血預適應對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用。 結(jié)果：1.成功克隆全HSP70cDNA，經(jīng)測序證實與Genbank中報道序列完全相同。 2.成功構(gòu)建腺相關(guān)病毒重組體pAAV-IRES-hrGFP/H

6、SP70，將此質(zhì)粒擴增、提純后與pAAV-Helper、pAAV-RC共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，通過同源重組獲得AAV-HSP70重組體，擴增后獲得高滴度的AAV-HSP70病毒液；經(jīng)測定其滴度為2.2×106pfu/ml，可進行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實驗。 3.AAV-HSP70轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞株(HKC)，經(jīng)免疫組化及蛋白印跡法檢測，HSP70可在體外培養(yǎng)的HKC細胞中高表達。 4.HSP70在HKC細胞中的高表達可

7、拮抗氧化損傷，與對照組相比，其細胞存活率升高，裂解細胞顯著減少。 5.大鼠缺血預適應后腎小管上皮細胞HSP70表達升高，其抗缺血再灌注損傷的能力顯著提高。 6.通過靜脈注射AAV-HSP70病毒液轉(zhuǎn)染大鼠后，可在大鼠腎小管上皮細胞中檢測到HSP70的高表達，HSP70的高表達使其抗缺血再灌注損傷的能力明顯提高。 結(jié)論：一、AAV-HSP70轉(zhuǎn)染后腎小管上皮細胞抗氧化損傷的能力有明顯的升高，其作用機制可能與HSP7