HSP70介導(dǎo)腎臟缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血再灌注損傷導(dǎo)致的急性腎功能衰竭(Acuterenalfailure,ARF)發(fā)生率很高，最近有關(guān)缺血預(yù)適應(yīng)(IschemiaPreconditioning，IP)預(yù)防缺血再灌注損傷的研究日益增多。器官短暫缺血/再灌注后能耐受更長時(shí)間缺血的現(xiàn)象稱為IP。IP現(xiàn)象最先發(fā)現(xiàn)于心臟，以后發(fā)現(xiàn)腎臟也存在缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象。缺血預(yù)適應(yīng)的機(jī)制尚未完全清楚。文獻(xiàn)報(bào)道，腎臟在缺血預(yù)適應(yīng)后，熱休克蛋白70(Heatshockproteins，HSP70)的

2、表達(dá)升高，HSP70的高表達(dá)是否參與IP保護(hù)腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)理，國內(nèi)外未見報(bào)道。本課題擬運(yùn)用腺相關(guān)病毒為真核表達(dá)載體制備含HSP70基因的重組腺相關(guān)病毒載體，進(jìn)行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，證明HSP70在腎臟缺血預(yù)適應(yīng)中是否介導(dǎo)保護(hù)作用。 目的：通過體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究AAV-HSP70基因轉(zhuǎn)染介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)作用及在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中介導(dǎo)的保護(hù)作用，探討HSP70在腎臟缺血預(yù)適應(yīng)中介導(dǎo)的保護(hù)作用機(jī)理。缺血預(yù)適

3、應(yīng)機(jī)制的深入研究對腎臟缺血再灌注損傷的防護(hù)及延長移植腎的存活時(shí)間有重要意義。 方法：第一部分：AAV-HSP70的構(gòu)建及表達(dá)1.RT-PCR法從人肝癌細(xì)胞系HepG2中克隆HSP70基因，獲得序列完全正確的全長HSP70cDNA。 2.用已克隆的正確序列HSP70基因片斷，構(gòu)建腺相關(guān)病毒重組體pAAV-IRES-hrGFP/HSP70，將此質(zhì)粒擴(kuò)增、提純后與pAAV-Helper、pAAV-RC共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，

4、通過同源重組獲得AAV-HSP70重組體，擴(kuò)增后獲得高滴度的AAV-HSP70病毒液。 第二部分：AAV-HSP70轉(zhuǎn)染對腎小管上皮細(xì)胞抗氧化氧損傷的保護(hù)作用將AAV-HSP70體外轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，通過免疫組化法檢測目的基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)，通過MTT法及51Cr釋放試驗(yàn)檢測在不同濃度的H2O2作用下HSP70的保護(hù)作用。 第三部分：AAV-HSP70轉(zhuǎn)染對大鼠缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究1.建立大鼠

5、腎缺血再灌注損傷模型及缺血預(yù)適應(yīng)模型，檢測HSP70的表達(dá)；62.將獲得的高滴度的AAV-HSP70病毒液通過靜脈注射轉(zhuǎn)染大鼠，檢測正常大鼠、轉(zhuǎn)基因大鼠及大鼠缺血預(yù)適應(yīng)后HSP70在大鼠腎臟的表達(dá)；觀察AAV-HSP70轉(zhuǎn)染介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 結(jié)果：1.成功克隆全HSP70cDNA，經(jīng)測序證實(shí)與Genbank中報(bào)道序列完全相同。 2.成功構(gòu)建腺相關(guān)病毒重組體pAAV-IRES-hrGFP/H

6、SP70，將此質(zhì)粒擴(kuò)增、提純后與pAAV-Helper、pAAV-RC共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，通過同源重組獲得AAV-HSP70重組體，擴(kuò)增后獲得高滴度的AAV-HSP70病毒液；經(jīng)測定其滴度為2.2×106pfu/ml，可進(jìn)行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。 3.AAV-HSP70轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞株(HKC)，經(jīng)免疫組化及蛋白印跡法檢測，HSP70可在體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞中高表達(dá)。 4.HSP70在HKC細(xì)胞中的高表達(dá)可

7、拮抗氧化損傷，與對照組相比，其細(xì)胞存活率升高，裂解細(xì)胞顯著減少。 5.大鼠缺血預(yù)適應(yīng)后腎小管上皮細(xì)胞HSP70表達(dá)升高，其抗缺血再灌注損傷的能力顯著提高。 6.通過靜脈注射AAV-HSP70病毒液轉(zhuǎn)染大鼠后，可在大鼠腎小管上皮細(xì)胞中檢測到HSP70的高表達(dá)，HSP70的高表達(dá)使其抗缺血再灌注損傷的能力明顯提高。 結(jié)論：一、AAV-HSP70轉(zhuǎn)染后腎小管上皮細(xì)胞抗氧化損傷的能力有明顯的升高，其作用機(jī)制可能與HSP7