TLR3介導(dǎo)的TRIF信號通路在腦缺血預(yù)適應(yīng)炎癥抑制中的作用研究.pdf

1、本研究擬探討TLR3(Toll-like receptor 3)介導(dǎo)的TRIF(Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor inducingIFN-β)信號通路是否參與了腦缺血預(yù)適應(yīng)后炎癥抑制過程。在離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上誘導(dǎo)IPC(ischemia preconditioning)保護(hù)模型,觀察此過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3信號通路關(guān)鍵蛋白TLR3、TRIF及pIRF3(phospho-i

2、nterferon regulatory factors)的表達(dá)規(guī)律及下游炎癥抑制因子IFN-β(interferonβ)和IL-10(Interleukin-10)的釋放量,同時檢測TLR4(Toll-like receptor 4)、pNF-κB(phospho-nuclear factor-κB)和其下游促炎因子TNF-ɑ(Tumor necrosis factor-α)和IL-6(interleukin-6)的釋放量。并進(jìn)一步使

3、用TLR3激動劑PolyI:C(Polyinosinic polycytidylic acid),觀察其對離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD(oxygen-glucose deprivation)損傷和整體小鼠腦缺血復(fù)灌損傷的保護(hù)作用及對缺血后炎癥反應(yīng)的影響,以闡明TLR3介導(dǎo)的腦缺血保護(hù)作用及作用機(jī)制。
　　第一部分：TLR3-TRIF信號通路及炎癥反應(yīng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用中的研究
　　目的:觀察TLR3-TRIF信

4、號通路關(guān)鍵蛋白在短暫缺氧缺糖預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧缺糖耐受中的表達(dá)規(guī)律及與星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放間的關(guān)系。
　　方法:細(xì)胞分四組,短暫氧糖剝奪1h復(fù)灌24h為IPC組,致死性氧糖剝奪12h為OGD組,短暫氧糖剝奪1h復(fù)灌24h后再次氧糖剝奪12h為IPC+OGD組,細(xì)胞不進(jìn)行任何處理為Control組。檢測細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)釋放量評價細(xì)胞損傷程度,Hochest33

5、258檢測細(xì)胞凋亡和壞死,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-β、IL-10含量。免疫熒光檢測細(xì)胞TLR3與TLR4蛋白表達(dá);western-blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3、TLR4、TRIF、pIRF3、pNF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)與Control組相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞單純IPC組細(xì)胞無明顯損傷,除TLR3蛋白表達(dá)升高外其它蛋白表達(dá)無明顯差異。(2)與Control組相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞O

6、GD組細(xì)胞活力下降,LDH漏出量增多并且細(xì)胞凋亡增多,培養(yǎng)液中TNF-ɑ、IL-6分泌增加,細(xì)胞TLR3、TLR4、pNF-κB蛋白表達(dá)升高。(3)與單純OGD組比較,IPC+OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力升高,LDH漏出量減少并且細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6分泌和細(xì)胞中TLR4、pNF-κB表達(dá)下降,而IFN-β分泌及細(xì)胞中TRIF、pIRF3蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論:短暫缺血缺氧預(yù)適應(yīng)對

7、隨后的長時間氧糖剝奪所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與預(yù)適應(yīng)過程一方面激活TLR3信號通路使抗炎因子IFN-β表達(dá)上調(diào),另一方面抑制TLR4及pNF-κB的表達(dá)使致炎因子IL-6的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　第二部分：PolyI:C對離體星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷及炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:觀察PolyI:C特異性激活TLR3-TRIF信號通路對星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷是否有保護(hù)作用,并探討保護(hù)作用是否與TLR3-TR

8、IF信號通路介導(dǎo)的抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。
　　方法:OGD12h誘導(dǎo)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血缺糖損傷,觀察10μg/mL和20μg/mLPolyI:C預(yù)孵育對星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血缺糖損傷的保護(hù)作用。檢測細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶釋放量評價細(xì)胞損傷程度。Hochest33258檢測細(xì)胞凋亡和壞死。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-β、IL-10含量。免疫熒光檢測細(xì)胞TLR3與TLR4蛋白表達(dá);western-blot檢

9、測星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3、TRIF、pIRF3、TLR4、pNF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)與Control組相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪12h后細(xì)胞活力下降,LDH漏出量增多,細(xì)胞凋亡增加。培養(yǎng)液中TNF-ɑ、IL-6含量增加,細(xì)胞TLR3、TLR4、pNF-κB蛋白表達(dá)升高。(2)與OGD組相比,PolyI:C預(yù)處理組能減輕細(xì)胞缺血缺氧損傷,抑制細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-6分泌減少,促進(jìn)IFN-β分泌增加,促進(jìn)細(xì)胞中TRI

10、F、pIRF3表達(dá),而對細(xì)胞TLR3、TLR4、pNF-κB蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論:10μg/mL和20μg/mLPolyI:C預(yù)處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧糖剝奪損傷有明顯的保護(hù)作用,激動TLR3-TRIF信號通路后可以減輕炎癥反應(yīng)。
　　第三部分：PolyI:C對小鼠腦缺血再灌注損傷及炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:觀察PolyI:C特異性激活TLR3-TRIF信號通路對小鼠的局灶性腦缺血損傷是否有保護(hù)作用,并探討保護(hù)

11、作用是否與TLR3-TRIF信號通路介導(dǎo)的抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。
　　方法:0.3mg/kgPolyI:C一次性肌肉注射給藥,24h后,左側(cè)大腦中動脈栓塞2h復(fù)灌6h、12h、22h誘導(dǎo)小鼠的腦缺血再灌注損傷模型,腦組織切片TTC染色測定腦梗死體積;ELISA檢測小鼠血清及腦組織勻漿炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-β、IL-10的含量,western-blot檢測缺血側(cè)腦組織TRIF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:左側(cè)大腦中動脈栓塞

12、2h復(fù)灌6h、12h、22h能穩(wěn)定地制作小鼠腦缺血再灌注損傷模型,小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)缺陷癥狀及腦組織梗死,同時外周血清TNF-ɑ含量增加,缺血復(fù)灌6h、12h、22h缺血側(cè)腦組織TNF-ɑ、IL-6表達(dá)升高。0.3mg/kgPolyI:C肌肉注射給藥能明顯改善小鼠神經(jīng)缺陷,減少腦梗死體積,降低缺血再灌12h和22h血清TNF-ɑ含量,并提高血清中IFN-β含量。0.3mg/kgPolyI:C預(yù)處理亦降低缺血再灌6h和12h缺血側(cè)腦組織T