生防菌盾殼霉產生抗真菌物質及其特性和防病潛力研究.pdf

1、油菜菌核病是由核盤菌［Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary］引起的一種世界性分布的重要病害。重寄生菌盾殼霉（Coniothyrmm minitans）是一種應用前景廣闊的生防菌。前人對盾殼霉寄生核盤菌的機制及其防病潛力進行了深入研究。McQuilken et al.（2003）報道了盾殼霉抑制核盤菌菌絲生長的抗生機制，并從盾殼霉培養(yǎng)物中分離和鑒定出抗真菌物質（Antifungal substance

2、，簡稱AFS）macrosphelldeA。但對其產生的規(guī)律、基本特性、能否抑制核盤菌菌核及子囊孢子萌發(fā)、是否能夠產生防病效果等問題還不明確。針對這些問題，我們開展了盾殼霉產生AFS及其特性和防病潛力研究。 用改良的查彼培養(yǎng)液（MCD）培養(yǎng)盾殼霉，制備含AFS的盾殼霉培養(yǎng)物濾液（MCD。m）。在-5鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上測定其對核盤菌菌絲生長、菌核萌發(fā)和子囊孢子萌發(fā)的抑制作用。結果表明：盾殼霉AFS對核盤菌菌絲生長具有

3、明顯的抑制作用。隨MCD。m（含AFS）濃度（x）提高，抑菌活性（y）增強。兩者之間的關系符合方程：y=19.268Ln（x）+44.152（R<`2>=0.9703，P<0.01）。被抑制的核盤菌菌絲原生質出現(xiàn)顆?；巴鉂B，菌絲細胞膨大，甚至潰解等異?，F(xiàn)象。用MCD<,cm>處理核盤菌菌核之后，菌核萌發(fā)延遲，但最終能完全萌發(fā)。說明盾殼霉AFS對核盤菌菌核沒有致死效應，但有一定程度的毒害作用；在含有MCD<,cm>的PDA平板上，核盤菌

4、子囊孢子能夠萌發(fā)，培養(yǎng)12h的萌發(fā)率達到99.4％，但芽管生長受到明顯抑制，出現(xiàn)細胞膨大和生長受阻等癥狀。 采用MCD培養(yǎng)液和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（potato dextrose broth，簡稱PDB）振蕩培養(yǎng)（20℃，200r／min）的方法研究了菌株和培養(yǎng)基種類對盾殼霉產生AFS的影響。結果表明：盾殼霉野生菌株Chy-1及其突變菌株Uv-2003能夠產生AFS，而Chy-1的另外兩個突變菌株Uv-202和Uv-1731卻不能

5、產生AFS。在MCD培養(yǎng)液中，培養(yǎng)盾殼霉6d后即檢測到AFS活性，培養(yǎng)12d~15d后，培養(yǎng)液對核盤菌菌絲生長的抑制率分別達到86.4％和89.7％。在3d~15d培養(yǎng)期間，培養(yǎng)液的pH值從4.6下降為3.6。在PDB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3d~15d后，培養(yǎng)液對核盤菌菌絲生長的抑制率低于17.8％。培養(yǎng)6d后，培養(yǎng)液的pH值從5.9（Od）上升至7.5，培養(yǎng)15d后，pH值下降為6.0。 分別以MCD和PDB為基礎，研究碳源、氮源、磷

6、酸鹽和環(huán)境pH值對盾殼霉產生AFS的影響。在碳源試驗中，以MCD為基礎時，供試7種碳源中，盾殼霉利用6種碳源（可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖）能產生AFS。葡萄糖和果糖對盾殼霉產生AFS最為適宜，而山梨醇則不適宜。以PDB為基礎時，7種供試碳源中，果糖和乳糖對盾殼霉產生AFS適宜，其它5種碳源（可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和山梨醇）則不適宜。在氮源試驗中，以MCD為基礎時，供試8種氮源中，7種氮源（硫酸銨、硝酸銨、蛋白

7、胨、谷氨酸、尿素、碳酸銨和丙氨酸）對盾殼霉產生AFS適宜，硝酸鉀則不適宜。以PDB為基礎時，供試8種氮源中，硝酸銨和谷氨酸對盾殼霉產生AFS適宜，而尿素、蛋白胨、硝酸鉀和丙氨酸等則不適宜。在磷酸鹽試驗中，以MCD為基礎時，添加磷酸鹽（1～10mM）對盾殼霉產生AFS沒有影響。以PDB為基礎時，添加磷酸鹽（1～10mM）對盾殼霉產生AFS有微弱的促進作用。在環(huán)境pH值試驗中，以MCD為基礎時，盾殼霉產生AFS的pH值范圍是2～8，最適宜的

8、pH值范圍是3～5。以PDB為基礎時，盾殼霉產生AFS的pH值范圍是2～6，最適宜的pH值范圍也是3～5。 在PDA培養(yǎng)基上測定了盾殼霉AFS的抑菌譜、耐熱性和在不同pH值條件下的穩(wěn)定性，在油菜葉片上測定了盾殼霉AFS對紫外線輻射的穩(wěn)定性。結果表明：在供試的16屬26種真菌中，盾殼霉AFS對核盤菌屬真菌（Sclerotinia）中的核盤菌（S．sclerotiorum）、三葉草核盤菌（S．trifoliorum）、小核盤菌（S．

9、minior）和雪腐核盤菌（S. nivalis）、葡萄孢屬真菌（Botrytis）中的橢圓葡萄孢（B. elliptica）、灰葡萄孢（B. cinerea）、蔥腐葡萄孢菌（B. aclada）、芍藥葡萄孢（B. paeoniae）和Botrytis sp OnionBC-19，以及鏈核盤菌屬真菌（Monilinia）中的果生鏈核盤菌（M. fructicola）等真菌具有較強的抑制作用。對其它13屬16種真菌沒有抑制作用，或抑制作用

10、較弱。盾殼霉AFS具有較強的熱穩(wěn)定性，在121℃下處理30min仍具有抑菌活性；在較寬的pH值范圍內（1～14），尤其是在酸性條件下，盾殼霉AFS活性穩(wěn)定；盾殼霉AFS對紫外線輻射具有抗性。 采用離體油菜葉片接種的方法研究了盾殼霉AFS對核盤菌侵染的抑制作用。結果表明：盾殼霉AFS單獨使用，或者與其分生孢子混用時，對核盤菌的侵染具有明顯的抑制作用?；煊脮r對防病效果的增效作用不明顯。 為探討盾殼霉AFS在其寄生核盤菌中的作

11、用，我們用盾殼霉接種核盤菌菌核（菌核試驗），檢測腐爛菌核提取物中是否存在AFS活性。還將盾殼霉接種在以核盤菌菌絲為唯一營養(yǎng)源的培養(yǎng)液中（菌絲試驗）或含有草酸的PDB培養(yǎng)液中（草酸試驗），培養(yǎng)9d后測定培養(yǎng)液對核盤菌菌絲生長的抑制作用。結果表明：在菌核試驗中，菌核提取液（80℃水浴處理1h）的抑菌活性為3．2％。在菌絲試驗中，培養(yǎng)盾殼霉后，培養(yǎng)液的pH值從5.5～6.1上升至7.3～8．0，培養(yǎng)物濾液的抑菌活性為0％～5.3％。在草酸試驗

12、中，添加8mM草酸的培養(yǎng)液的pH值由3．8上升至5.4，抑菌百分率為44.3％，而添加40mM草酸的培養(yǎng)液的pH值由2.1上升至2.4，抑菌百分率為80.7％。這些結果暗示：在盾殼霉寄生核盤菌菌核中可能沒有AFS參與。而在寄生核盤菌菌絲中，AFS可能參與，這同核盤菌分泌草酸所營造的酸性環(huán)境有關。 上述研究中，關于盾殼霉AFS抑制核盤菌菌絲生長及侵染油菜組織、抑制核盤菌菌核萌發(fā)和子囊孢子萌發(fā)后芽管發(fā)育等結果為利用盾殼霉AFS防治油