盾殼霉T-DNA標記插入突變體庫的構(gòu)建及其質(zhì)量評估.pdf_第1頁
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1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生真菌,在世界范圍內(nèi)廣泛存在,是作物菌核病的一種重要生防菌.該論文對農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefacien-mediated transformation,ATMT)盾殼霉的轉(zhuǎn)化條件進行了研究,并對構(gòu)建的T-DNA標記插入體庫進行了評價.構(gòu)建了用轉(zhuǎn)化的雙元載體,即將來自構(gòu)巢曲霉(Aspergil

2、lus nidulans)的trpC啟動子替代用于轉(zhuǎn)化植物的雙元載體pCAMBIA1301中的CaMV 35S啟動子,獲得的載體pTFCM,經(jīng)過熱擊導入農(nóng)桿菌EAH105菌株用于轉(zhuǎn)化.實驗證明pTFCM轉(zhuǎn)化循殼霉具有較高的轉(zhuǎn)化效率.通過對農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化盾殼霉條件的探索優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)盾殼霉在生長17天后所產(chǎn)生的孢子用于轉(zhuǎn)化時效率明顯提高;孢子濃度對轉(zhuǎn)化效率影響較大,用10<'8>個/ml的濃度進行轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯高于10<'9>個/m

3、l和10<'7>個/ml孢子濃度進行轉(zhuǎn)化時的轉(zhuǎn)化子數(shù)量.任意選取10個轉(zhuǎn)化菌株于PDA上培養(yǎng)6代(無性繁殖),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有測試的轉(zhuǎn)化子各子代均能在含60μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上生長,而出發(fā)菌株ZS-1不能生長,說明T-DNA標記轉(zhuǎn)化子在遺傳上是穩(wěn)定的.為了評價轉(zhuǎn)化子T-DNA插入拷貝數(shù),任意選取58個轉(zhuǎn)化子進行基因組Southern雜交分析,發(fā)現(xiàn)有48個菌株為單拷貝,4個菌株為雙拷貝,另外6個菌株的實驗沒有結(jié)果,表明單拷貝所占比

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