轉(zhuǎn)Harpin-,Xooc-蛋白編碼基因?qū)τ筒宿r(nóng)藝性狀及抗菌核病的影響.pdf

1、由革蘭氏陰性植物病原細菌產(chǎn)生的Harpins可以激發(fā)煙草過敏性細胞壞死(hvpersensitive cell death，HCD)，誘導植物抗病、抗蟲，促進植物生長。Harpins類激發(fā)子都具有相似的生化特征：富含甘氨酸(Gly)，不含半胱氨酸(Cys)，熱穩(wěn)定，對蛋白酶敏感。溫室和田間實驗表明，Harpins蛋白處理植物可以誘導對真菌、細菌、病毒、線蟲等多種病原物的抵抗，提高植物的產(chǎn)量。此外，將harpin轉(zhuǎn)化煙草，水稻，梨樹，都能

2、不同程度的提高轉(zhuǎn)基因植株的抗性。因此，本研究旨在將編碼harpin<,Xooc>的基因hrf2轉(zhuǎn)化油菜，以期提高油菜的抗病性和產(chǎn)量。 hrf2基因來源于水稻細條斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola 菌株RS105，該基因含414 bp，其推測的產(chǎn)物Hrf2含138個氨基酸，分子量約為15.3×10<'3>。hrf2基因編碼的harpin<,Xooc>蛋白具有與其他Harpins蛋白類似的特征和功能。

3、hrf2表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠誘導植物抗病性、抗蟲性和促進植物生長等有益效應。 本實驗通過PCR方法，從水稻細條斑菌Xanthomonas oryzae pv．oryzicola菌株RS105中擴增出hrf2基因，將其克隆入植物表達載體pBI121，構(gòu)建pBIl21：：hrf2重組質(zhì)粒。然后將hrf2基因及其啟動子和終止子用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ從pBIl21：：hrf2上切下后回收，連接到用這兩個酶切過的轉(zhuǎn)基因表達載體pCA

4、MBIA1301上，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1301：：hrf2。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)酶切，測序驗證后，通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404。菌落PCR和酶切檢測后，挑選陽性克隆供轉(zhuǎn)化油菜使用。 由根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導，將重組表達質(zhì)粒pCAMBIA1301：：hrf2轉(zhuǎn)化甘藍型油菜楊油4號子葉節(jié)，獲得了抗潮霉素的再生轉(zhuǎn)基因油菜植株。經(jīng)PCR，Southem，RT-PCR和GUS染色檢測證明h

5、rf2基因已整合到油菜基因組中，并且能在轉(zhuǎn)錄水平正常表達。從轉(zhuǎn)hrf2基因的油菜中提取的可溶性蛋白注射煙草能引起過敏反應。 在相同培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因油菜的株高、葉片大小與受體植株無明顯差異，生長發(fā)育正常，無肉眼可見的HR。轉(zhuǎn)基因油菜的花期略有推遲，結(jié)實率差異較大；所有轉(zhuǎn)基因植株的每莢粒數(shù)均少于對照，但部分轉(zhuǎn)基因植株的千粒重與對照相比顯著增加。T1代油菜種子在含有hyg 50 mg/L的培養(yǎng)基上出現(xiàn)抗感分化?？共⌒澡b定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)