利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選GmDREB5的互作蛋白及核蛋白篩選系統(tǒng)（NTT）的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子在高等植物的生長發(fā)育及其對外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。典型的高等植物的轉(zhuǎn)錄因子含有：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域、寡聚化位點和核定位信號，轉(zhuǎn)錄因子通過這些結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)順式作用元件結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)。DREB(dehydration responsive element binding protein)是一類與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。研究證明DREB轉(zhuǎn)錄因子可以同時調(diào)控多個與抗逆相關(guān)的下游基因的表達(dá)，綜合提高植物對逆境的抵抗能

2、力。DREB轉(zhuǎn)錄因子的活性受到很多互作蛋白的調(diào)控，研究這些互作蛋白是闡明植物抗逆作用機(jī)制的基礎(chǔ)。 前期工作已經(jīng)證明大豆抗逆相關(guān)GmDREB5轉(zhuǎn)錄因子具有DREB蛋白的基本特性，而且可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性和耐鹽性。在此基礎(chǔ)上，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)從干旱處理5小時的大豆cDNA文庫中篩選與GmDREB5的互作蛋白。 誘餌載體的構(gòu)建：首先為了排除GmDREB5蛋白的自激活區(qū)域，減少假陽性，利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(http:

3、//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan)預(yù)測GmDREB5蛋白可能的修飾位點，根據(jù)預(yù)測結(jié)果把GmDREB5基因分成三個區(qū)段，分別克隆到酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體上(pGBKT7)，通過酵母的自激活實驗確定GmDREB5蛋白的73位至226位氨基酸的區(qū)段(pGBKT7-IIR)可以作為誘餌；cDNA文庫的構(gòu)建及篩選：以耐鹽性好的大豆品種鐵豐8號為材料，對幼苗干旱處理5 h提取總RNA，應(yīng)用SMART技術(shù)

4、合成第一鏈cDNA。然后用5’和3’PCR引物進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增，合成雙鏈cDNA,通過定位重組酶將文庫構(gòu)建到酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選載體上(pGADT7)，與誘餌載體混合后共同轉(zhuǎn)化酵母AH 109；克隆的鑒定：通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基的篩選獲得了總共500多個酵母克隆，通過進(jìn)一步的鑒定和測序確定其中一個陽性克隆是含TPR(Tetratricopeptide repeat)保守域的蛋白，將其定名為GmTPRl。將GmTPR1與植物中其它6個帶

5、有TPR保守域的蛋白進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)同源性最高的只有14％。采用RT-PCR的方法對GmTPR1基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明GmTPR1基因受干旱、低溫、高鹽和ABA的誘導(dǎo)。根據(jù)已有的結(jié)果，推測GmTPR1它可能參與核孔復(fù)合物的形成，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核：也可能參與蛋白復(fù)合物的形成，促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互作用。植物的核蛋白在植物發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等生理過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，研究植物核蛋白的組成及動態(tài)變化是研究植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)

6、絡(luò)的基礎(chǔ)。為了研究植物核蛋白的動態(tài)組成，本研究利用核蛋白都具有核定位信號(nuclearlocalization signals，NLS)的特性篩選編碼核蛋白的基因，建立了一套快速、省力和低成本的核蛋白篩選系統(tǒng)(nucleartransportation trap，NTT)。通過鑒定發(fā)現(xiàn)，將合成的SV40蛋白大T抗原的核定位信號序列插入篩選載體的多克隆位點，轉(zhuǎn)化酵母EGY48，插入核定位信號的篩選載體轉(zhuǎn)化酵母后可以在選擇性培養(yǎng)基(SD/

7、His-/Leu-)上生長，而沒有插入核定位信號的篩選載體轉(zhuǎn)化酵母后不能在選擇性培養(yǎng)基上生長，從而證明此核蛋白篩選系統(tǒng)有效。通過比較實驗表明，本研究構(gòu)建的核蛋白篩選系統(tǒng)與已報道的系統(tǒng)相比篩選效率更高。利用此系統(tǒng)從eDNA文庫中分離編碼核蛋白的基因，對于研究核蛋白的動態(tài)組成，了解核蛋白基因在調(diào)控植物細(xì)胞發(fā)育及環(huán)境脅迫響應(yīng)的作用機(jī)制具有重要的意義。利用構(gòu)建的NTT系統(tǒng)篩選干旱處理小白麥cDNA文庫，共獲得了500多個酵母克隆，對其中部分克隆