新型鴨細(xì)小病毒DS-15株生物學(xué)特性研究及間接ELISA方法的建立.pdf

1、2014年以來(lái)，在中國(guó)許多櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行一種“鴨大舌病”，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為鴨生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，鴨喙萎縮舌頭外露下垂，跛行癱瘓等，又稱(chēng)鴨短喙-侏儒綜合征。已經(jīng)鑒定出該病的病原是一種新型鴨細(xì)小病毒(Novel duck parvovirus，NDPV)。目前對(duì)此病毒的生物學(xué)特性暫不清楚，臨床上還沒(méi)有有效的疫苗或藥物行防治，也沒(méi)有檢測(cè)該病毒的方法或技術(shù)。為此，本研究對(duì)NDPV DS-15株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，同時(shí)為了給該病的流

2、行病學(xué)調(diào)查提供一個(gè)可靠的檢測(cè)方法，還對(duì)NDPV的主要抗原蛋白VP3進(jìn)行了表達(dá)和純化，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)NDPV抗體的ELISA方法。
　　首先，對(duì)新型鴨細(xì)小病毒DS-15株在鴨胚上的增殖特性及對(duì)鴨胚的致病力進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示，鴨胚接種NDPV DS-15株以后，96～120h出現(xiàn)死亡，胚體全身出血，病毒滴度(ELD50)為10-5.5/0.2mL。以鴨胚增殖的病毒感染櫻桃谷肉鴨，成功復(fù)制出典型的“鴨大舌病”臨床癥狀，并從發(fā)

3、病鴨臟器中分離到病毒。
　　其次，根據(jù)NDPV DS-15株的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增VP3基因并將其序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的部分GPV及MDPV分離株的VP3基因進(jìn)行比對(duì)和分析。結(jié)果表明，NDPV DS-15株VP3基因與鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為91.4％～98.4％和96.6％～98.1％，而與番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)核苷

4、酸和氨基酸同源性則較低，分別為81.4％～91.5％和91％～97％;在親緣關(guān)系方面，NDPV DS-15株與GPV較近，提示二者可能是由同一病毒進(jìn)化而來(lái)。
　　最后，將NDPV的VP3基因克隆并插入到pGEX-4T-1中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-VP3，誘導(dǎo)表達(dá)重組GST-VP3蛋白，重組蛋白分子量為84kDa。Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示重組VP3蛋白能與NDPV多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，重組VP3蛋白具備用作診斷

5、抗原的潛力。以表達(dá)的VP3蛋白作為抗原，包被ELISA板;然后，分別對(duì)包被抗原的濃度及條件、抗原封閉條件、一抗的孵育條件、酶標(biāo)二抗的孵育條件和顯色條件等進(jìn)行優(yōu)化，最終成功建立間接ELISA方法，確定方法的陽(yáng)性閾值為0.35。所建立的方法有較好的重復(fù)性，運(yùn)用該方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行了初步檢測(cè)，結(jié)果表明該方法可用于NDPV疫苗的免疫效力評(píng)價(jià)，及NDPV感染鴨群的流行病學(xué)調(diào)查，同時(shí)也可用于鴨群GPV的檢測(cè)。
　　綜上，本論文對(duì)NDPV的增殖