鵝細(xì)小病毒單克隆抗體的制備及單抗雙夾心ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鵝細(xì)小病毒病是由小鵝瘟病毒引起的雛鵝或雛番鴨的一種病毒性疾病。此病具有敗血性和高度接觸性對(duì)一月齡雛鵝發(fā)病率和死亡率高達(dá)95％-100%。由于該病病的傳染性較強(qiáng)、發(fā)病時(shí)間較短、死亡率較高而給我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)該病診斷主要借助臨床癥狀的觀察及病理剖檢變化觀察等手段做出判斷，但僅為初步診斷，難以做出準(zhǔn)確的診斷。想要做出較準(zhǔn)確的診斷，常借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法。主要有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和性試驗(yàn)等檢測(cè)方法，但上述方法都相應(yīng)的缺乏敏

2、感性或特異性，也不適合大批量檢測(cè)等缺點(diǎn)。對(duì)該病治療除對(duì)雛鵝注射抗血清或卵黃抗體外尚無其它有效的辦法。由于本病在診斷、預(yù)防和治療三方面都存在弊端，因此臨床上急需要一種對(duì)該病治療效果好的生物制劑和一種簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異同時(shí)能大批量檢測(cè)的診斷方法。
　　本試驗(yàn)利用濃縮的GPV免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，經(jīng)間接ELISA方法篩選和有限稀釋法克隆后獲得一株抗GPV的雜交瘤細(xì)胞系（4B4）。經(jīng)鑒定，其MAb的亞型為IgG1型，輕

3、鏈為κ型。ELISA和western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的4B4 MAb可特異性的識(shí)別GPV，并可特異性識(shí)別GPV VP3蛋白，表明4B4 MAb識(shí)別的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守區(qū)域。
　　為建立鵝細(xì)小病毒（GPV）檢測(cè)方法，本研究以兔抗GPV IgG為捕獲抗體，抗GPV單克隆抗體為檢測(cè)抗體。通過方陣試驗(yàn)確定了兔抗GPV IgG最適包被濃度為16μg/m L，抗GPV單克隆抗體最佳工作濃度為10.8μg/

4、m L，酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1：4000。成功建立了檢測(cè)GPV單抗雙夾心ELISA方法，該方法對(duì)GPV檢測(cè)靈敏度達(dá)0.312μg/m L。用該法對(duì)延邊某養(yǎng)鵝場(chǎng)疑似小鵝瘟病的252只雛鵝進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽性率為75.79%，與龔建森建立的雙抗夾心ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)91.11%。
　　本研究制備了抗鵝細(xì)小病毒單克隆抗體，并建立了單抗雙夾心ELISA方法。為臨床研制GPV診斷試劑、治療試劑的奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為GPV的檢測(cè)和