鵝細(xì)小病毒特異PCR及其抗體間接ELISA檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、1956年我國(guó)方定一在揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)小鵝瘟(Goose plague，GP)，1961年用鵝胚分離病毒并命名為小鵝瘟病毒(GP Virus，GPV)，后定名為鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)。GPV侵害雛鵝和4-8周齡小鵝及雛番鴨(Muscovy Ducklings)，傳染性強(qiáng)、傳播迅速、死亡率達(dá)90％以上，嚴(yán)重危害水禽業(yè)發(fā)展。德、匈、荷、法、英、意、以、日、南、前蘇聯(lián)、和越南等國(guó)家有GPV爆發(fā)流行文獻(xiàn)報(bào)道。 2

2、004年，ICTV八次報(bào)告將GPV新分類為細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)依賴病毒屬(Dependovirus)。同屬成員中還有番鴨三周病的病原，即番鴨細(xì)小病毒(Moscovy duck parvovirus，MDPV)。文獻(xiàn)報(bào)道，MDPV只引起番鴨發(fā)病，且與GPV引起的番鴨病十分相似。MDPV與GPV基因組同源性很高，為81.9％，常規(guī)血清學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)難以區(qū)分它們。近年來(lái)，我國(guó)鵝及番鴨養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅速，疫病危害愈來(lái)愈

3、重，生產(chǎn)實(shí)際中非常需要能將GPV與MDPV從病原及其抗體進(jìn)行鑒別診斷的技術(shù)。 1、本文報(bào)道建立的GPV特異PCR方法。用Limn CK報(bào)道的AL18R2/AL18F2引物和CHUCY報(bào)道的GPVR/GPVF引物，對(duì)GPV和MDPV參考毒株進(jìn)行GPV VP3基因中806bp片段和VPl全基因序列(大小為2206bp)擴(kuò)增，均獲得了陽(yáng)性結(jié)果。純化的PCR產(chǎn)物核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AL18R2/AL18F2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBa

4、nk中的GPV強(qiáng)毒B株(U25749)和MDPVGD株(AY510603)基因同源性分別為97％和99％，兩個(gè)病毒PCR產(chǎn)物之間同源性僅為81.1％。GPVF/GPVR引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GPV強(qiáng)毒B株和MDPV GD株比較，同源性分別為97％和99％，兩產(chǎn)物之間的同源性僅為80.3％。結(jié)果表明，引物AL18R2/AL18F2和引物GPVF/GPVR建立的PCR檢測(cè)技術(shù)在結(jié)合PCR產(chǎn)物DNA序列測(cè)定時(shí)可以從基因水平區(qū)別GPV和MDPV。

5、PCR及其產(chǎn)物序列測(cè)定結(jié)合起來(lái)的技術(shù)被稱為PCRS(PCR and sequencing)。 應(yīng)用中我們體會(huì)到，PCRS費(fèi)時(shí)(8天)，費(fèi)用高，每樣試劑費(fèi)80元以上，實(shí)際推廣應(yīng)用難度大。為此，根據(jù)Zoltan Z報(bào)道，新設(shè)計(jì)引物HJU/HJL，結(jié)果是PCR檢測(cè)時(shí)只有GPV參考株出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，而MDPV參考株則為陰性。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，GPV參考株P(guān)CR產(chǎn)物與GPV強(qiáng)毒B株核苷酸同源性為99％。采用新引物HJU/HJL PCR技術(shù)，勿需D

6、NA序列測(cè)定即可確診GPV，特異，快速(30小時(shí))，費(fèi)用低，每樣試劑費(fèi)29元。 2、運(yùn)用我們建立的GPV特異PCR方法，對(duì)自然發(fā)病小鵝組織中病毒分布進(jìn)行檢測(cè)。4只11日齡病死小鵝胰腺(75％)、十二指腸(75％)和肺(75％)檢出陽(yáng)性：4只48日齡病死鵝心、肝、脾、肺、腎、胰腺和腦組織陽(yáng)性檢出率為100％，十二指腸為66.7％。結(jié)論是，臨床診斷時(shí)胰腺胰腺、肺、。腎和十二指腸組織病料陽(yáng)性檢測(cè)率高。本文確診48日齡鵝的小鵝瘟，如此大

7、日齡鵝發(fā)病，值得重視和研究。 3、來(lái)自四川、廣'東、廣西、重慶四省市的鵝病料13份，采用AL18R2/AL18F2引物和GPVF/GPVR引物檢測(cè)，陽(yáng)性樣品數(shù)分別為8份和4份。將AL18R2/AL18F2引物：PCR擴(kuò)增的8份陽(yáng)性PCR產(chǎn)物DNA序列與GPV強(qiáng)毒B株比較，同源性為96.20％～98.59％，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸同源性為95.6％～100％，核苷酸變異率較高的位點(diǎn)有8處，即3212bp、3891bp、3828bp、3824b

8、p、3723bp、3442bp、3410bp和3345bp處；氨基酸變異位點(diǎn)有2個(gè)，即VP蛋白463位的甘氨酸(G)變成了絲氨酸(S)，485位的蘇氨酸(T)變成了丙氨酸(A)。GPVF/GPVR.引物擴(kuò)增的2份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物DNA序列與GPV強(qiáng)毒B株比較，核苷酸同源性為96.0％和96.3％，推導(dǎo)的氨基酸同源性為95.3％和95.2％。核苷酸變異主要位于3899bp～4032bp序列(多達(dá)12處變異)和VP1與VP2起始密碼子之間的區(qū)

9、域，即2560bp～2844bp內(nèi)(8處變異)。氨基酸變異位點(diǎn)有6個(gè)，分別位于VP蛋白的第207、210、525、528、562和707位。親水性和抗原性分析表明，來(lái)自4個(gè)省市的8份GPV樣品變異很小或沒(méi)有變異。 4、鴨胚致弱的GPV SRW毒株鴨胚尿囊液經(jīng)氯仿處理，PEG6000沉淀，Sephadex G-200層析純化制備的GPV抗原，以41.75μg/ml濃度包被后，加入待檢血清，以后依次加入兔抗鵝IgG(1:400)和山