刺參(Apostichopus japonicus)在氨氮脅迫下解毒代謝途徑與生理健康評(píng)價(jià)技術(shù)的研究.pdf

1、氨氮是養(yǎng)殖水環(huán)境中重要的污染脅迫因子。本文通過研究刺參在氨氮脅迫下解毒代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析、酶活性和含氮化合物含量變化,以及免疫和抗氧化指標(biāo)的變化情況,初步探討了刺參在氨氮脅迫下的解毒代謝機(jī)制和生理健康水平,主要包括三方面內(nèi)容:
　　(1)刺參谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)基因片段的克隆和序列分析;
　　(2)刺參在氨氮脅迫下體內(nèi)氨轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑的研究;
　　(3)氨氮脅迫對(duì)刺參免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

2、。主要結(jié)果如下:
　　1刺參氨氮解毒代謝相關(guān)基因片段的克隆和序列分析
　　本文以刺參呼吸樹為模板,利用COEDHOP網(wǎng)站和Primer Premier5.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,通過RT-PCR擴(kuò)增技術(shù),克隆了刺參GDH基因和GS基因的部分序列。其中,GDH基因片段長(zhǎng)693bp,編碼231個(gè)氨基酸,通過氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)其與點(diǎn)蜂緣蝽(Riptortus pedestris)的相似性最高,為78％,GeneBank注冊(cè)號(hào)為 KJ83

3、9834;GS基因片段長(zhǎng)636bp,編碼212個(gè)氨基酸,其與普通海膽(Paracentrotus lividus)的相似性最高,為78%,GeneBank注冊(cè)號(hào)為KJ839835。
　　2刺參在氨氮脅迫下體內(nèi)氨轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑的研究
　　本實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置為:對(duì)照組(自然海水--0.01mg/L)、0.5mg/L、1.25mg/L處理組,取樣時(shí)間為0、2、6、12、24和48h,分別取刺參的體腔液、呼吸樹和體壁等組織,測(cè)定谷氨酸脫

4、氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)活力、谷氨酰胺(Gln)含量和黃嘌呤氧化還原酶(XOR)活力、尿酸(UA)含量、精氨酸酶(Arg)活力、尿素(Urea)含量以及關(guān)鍵基因表達(dá)水平等指標(biāo)。結(jié)果表明:氨氮脅迫對(duì)刺參體腔液氨氮含量和呼吸樹、體壁和體腔液的GDH、GS活力、Gln含量、XOR活力、Arg活力、Urea含量以及呼吸樹GDH、GS、XOR、Arg基因表達(dá)影響顯著(P<0.05),而對(duì)照組無明顯差異,其中各組織 UA含量和體腔液

5、XOR活力均未檢測(cè)出。各染毒處理組體腔液氨氮含量在24h內(nèi)呈峰值變化,于6h達(dá)到最大值,24h后保持穩(wěn)定,并顯著高于對(duì)照組水平(P<0.05)。各處理組呼吸樹GDH活力、GDH mRNA表達(dá)和GS活力、GS mRNA表達(dá)、Gln含量分別在12、24h內(nèi)逐漸升高,之后趨于穩(wěn)定(P<0.05);體壁 GDH活力在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈峰值變化,于12h時(shí)達(dá)到最大值,48h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平,而GS活力、Gln含量在12h內(nèi)逐漸升高,12h后保持穩(wěn)定(

6、P<0.05);體腔液GDH活力在12h內(nèi)逐漸升高,然后保持穩(wěn)定(P<0.05),而 GS活力、Gln含量在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)無顯著變化。呼吸樹Arg活力、Arg mRNA表達(dá)和Urea含量在12h內(nèi)逐漸升高,之后保持穩(wěn)定(P<0.05),而體壁XOR、Arg活力和Urea含量在48h內(nèi)呈峰值變化,分別于6、12和12h達(dá)到最大值,48h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平;呼吸樹XOR活力、XOR mRNA表達(dá)和體腔液 Arg活力、Urea含量與對(duì)照組均無顯著

7、差異。由此說明,刺參體內(nèi)具有氨氮的解毒代謝途徑,可以通過將氨氮轉(zhuǎn)化為Gln和Urea來降低氨氮對(duì)機(jī)體的毒害作用。
　　3氨氮脅迫對(duì)刺參免疫和抗氧化指標(biāo)的影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)0、0.5和1.25mg/L氨氮處理組,0、2、6、12、24、48h取樣,測(cè)定了刺參體腔液總體腔細(xì)胞數(shù)、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性,以及體腔液和體壁的總抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)活力,還原型谷胱甘肽(GSH)含量以及還原性谷胱甘肽/

8、氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)。結(jié)果表明,氨氮脅迫對(duì)刺參體腔液總體腔細(xì)胞數(shù)量、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性,以及體腔液和體壁的T-AOC能力,SOD活力,GSH含量以及GSH/GSSG等指標(biāo)影響顯著。各處理組中,總體腔細(xì)胞數(shù)量在12h內(nèi)顯著降低,之后逐漸上升并恢復(fù)至對(duì)照組水平;溶菌活力則在6h內(nèi)逐漸升高,之后迅速下降至對(duì)照組水平;溶菌活力和凝集活力則呈不同程度的下降趨勢(shì)。體腔液T-AOC能力、SOD活性、GSH含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其