三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在氨氮脅迫下解毒代謝機(jī)制的研究.pdf

1、氨氮是養(yǎng)殖水體中常見的重要污染脅迫因子。本文通過對三疣梭子蟹解毒代謝關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析,測定解毒代謝關(guān)鍵酶活力和相關(guān)產(chǎn)物含量的變化,研究了氨氮脅迫對三疣梭子蟹氨氮轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑相關(guān)指標(biāo)的影響,初步探討了三疣梭子蟹在氨氮脅迫下的解毒代謝機(jī)制。本論文主要包括以下三方面內(nèi)容:(1)三疣梭子蟹解毒代謝關(guān)鍵基因的克隆與序列分析;(2)氨氮脅迫對三疣梭子蟹轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響;(3)氨氮脅迫對三疣梭子蟹代謝途徑的影響。主要結(jié)果如下:
　　1

2、.三疣梭子蟹解毒代謝關(guān)鍵基因的克隆與序列分析
　　通過設(shè)計(jì)兼并引物,利用RT-PCR方法從三疣梭子蟹鰓絲和肝胰臟分別克隆得到Rh蛋白和谷氨酸脫氫酶(GDH)部分基因序列。本實(shí)驗(yàn)克隆Rh蛋白基因所用的上、下游引物分別是5’-TGGGCCATCCTGGTGaayggnttytt-3’和5’-GGCGGCGccccanggrtg-3’,克隆得到的Rh蛋白cDNA片段長612bp,編碼204個(gè)氨基酸序列,Rh蛋白氨基酸序列與其它蟹類相似性

3、為86％-91%;克隆GDH所使用的上游引物序列是5’-ATGATCGGCATCACCccnggntgggg-3’,下游引物序列是5’-TGGGGGATCACCAGCAcrttcatrtcyt-3’,克隆得到的谷氨酸脫氫酶cDNA片段長414bp,編碼138個(gè)氨基酸序列,谷氨酸脫氫酶氨基酸序列與其它蝦蟹類相似性為92%-96%。
　　2.氨氮脅迫對三疣梭子蟹轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響
　　本文研究了氨氮脅迫對三疣梭子蟹鰓絲、肝胰臟、肌肉

4、及血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑的影響。結(jié)果表明,氨氮脅迫對三疣梭子蟹血淋巴氨氮含量和鰓、肝胰臟、肌肉、血淋巴GDH、谷氨酰胺合成酶(GS)活力、Gln含量以及Rh-protein、GDH、GS基因表達(dá)影響顯著,而對照組無明顯變化(P<0.05)。各染毒處理組鰓GDH活力在12h內(nèi)顯著升高,然后保持穩(wěn)定;Rh-protein、GDH mRNA和GS活力、mRNA表達(dá)以及Gln含量均在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈峰值變化,于6h或12h時(shí)達(dá)到最大值,其中Rh-pro

5、tein、GDH mRNA在48h時(shí)顯著高于對照組水平,GS活力、mRNA表達(dá)恢復(fù)至對照組水平,而Gln含量在6 h后保持穩(wěn)定,并明顯高于對照組水平,且與染毒濃度呈正相關(guān)。肝胰臟GDH活力、mRNA表達(dá)僅在6h或2h時(shí)高于對照組水平,其余與對照組差異不顯著;各染毒組Rh-protein mRNA表達(dá)和GS活力、mRNA表達(dá)分別在48h、24h內(nèi)呈峰值變化,均于12h達(dá)到最大值,然后恢復(fù)至對照組水平或趨于穩(wěn)定、高于對照組水平;Gln含量在

6、6 h內(nèi)呈逐漸明顯上升趨勢,然后保持穩(wěn)定,與染毒濃度呈正相關(guān)。高濃度組肌肉 GDH活力在6h內(nèi)逐漸升高,之后趨于穩(wěn)定,而低濃度組與對照組無明顯差異;Rh-protein、GDH和GS mRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈峰值變化,分別于12h或24h時(shí)達(dá)到最大值,48h時(shí)恢復(fù)或高于對照組水平;GS活力、Gln含量分別于12h、24h內(nèi)明顯升高,然后保持穩(wěn)定,且與染毒濃度呈明顯正相關(guān)。各處理組血淋巴 HA含量僅在6h時(shí)顯著高于對照組水平,高濃度組G

7、DH活力在6h內(nèi)明顯升高,之后趨于穩(wěn)定,其余與對照組無明顯差異;GS活力、Gln含量于12h內(nèi)明顯升高,然后保持穩(wěn)定,且與染毒濃度呈明顯正相關(guān)。
　　由此可見,三疣梭子蟹在氨氮脅迫下轉(zhuǎn)運(yùn)代謝指標(biāo)表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)性,短時(shí)間內(nèi)應(yīng)激升高,而且轉(zhuǎn)運(yùn)代謝酶基因表達(dá)與酶活力的變化具有明顯的一致性,之后恢復(fù)或高于對照組水平,僅各組織Gln含量和肌肉、血淋巴的GS活力呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng),同時(shí) Rh蛋白應(yīng)激時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)水平大小為鰓>肝胰臟、肌肉,轉(zhuǎn)

8、運(yùn)代謝酶活力為肌肉>鰓>血淋巴>肝胰臟,Gln含量為肌肉>肝胰臟>鰓>血淋巴,說明三疣梭子蟹在氨氮脅迫下轉(zhuǎn)運(yùn)代謝未受到抑制,主要在肌肉轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺儲(chǔ)存利用,各組織Gln含量可作為三疣梭子蟹在氨氮脅迫下解毒代謝水平的評價(jià)指標(biāo)。
　　3.氨氮脅迫對三疣梭子蟹代謝途徑的影響
　　本文研究了氨氮脅迫對三疣梭子蟹鰓絲、肝胰臟、肌肉及血淋巴氨代謝指標(biāo)的影響。結(jié)果表明,氨氮脅迫對三疣梭子蟹鰓、肝胰臟、肌肉和血淋巴黃嘌呤脫氫酶(XDH)基

9、因表達(dá)和尿酸(UA)含量、精氨酸酶(ARG)基因表達(dá)和活力及尿素(UR)含量有顯著性影響,而對照組無明顯變化(P<0.05)。其中除血淋巴檢測出UA含量外,各組織XOR活力和尿酸含量均未檢測出。各染毒組鰓XDH mRNA表達(dá)、ARG活力、mRNA表達(dá)均在48h內(nèi)呈峰值變化,分別于2h、6h和2h達(dá)到最小值和最大值,48h時(shí)顯著低于對照組或恢復(fù)至對照組水平;UR含量在12h內(nèi)呈峰值變化,在6h達(dá)到最大值,12h后保持穩(wěn)定,并明顯高于對照組

10、水平。各染毒組肝胰臟XDH和ARG mRNA表達(dá)均在48h內(nèi)呈峰值變化,分別于12h、6h達(dá)到最大值,然后恢復(fù)至對照組水平或明顯高于對照組水平,而ARG活力與UR含量分別在6h、2h內(nèi)顯著升高,然后保持穩(wěn)定。各染毒組肌肉XDH mRNA表達(dá)和ARG活力、mRNA表達(dá)和UR含量分別在48h或24h內(nèi)呈峰值變化,于12h或6h達(dá)到最大值,其中XDH、ARG mRNA表達(dá)、UR含量在48h時(shí)恢復(fù)或高于對照組水平,ARG活力12h后保持穩(wěn)定,且

11、與染毒濃度呈正相關(guān)。各染毒處理組血淋巴UA含量、ARG活力、UR含量在24h內(nèi)呈峰值變化,均于6h達(dá)到最大值,之后ARG活力恢復(fù)至對照組水平,而UA、UR含量趨于穩(wěn)定,且明顯高于對照組水平,與染毒濃度呈正相關(guān)性。
　　由此可見,三疣梭子蟹在氨氮脅迫下尿酸、尿素形成代謝(排出代謝)指標(biāo)表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)性,短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),而且排出代謝酶基因表達(dá)與酶活力的變化具有明顯的一致性,然后除鰓XDH mRNA表達(dá)外,均恢復(fù)或或明顯高于

12、對照組水平,僅肌肉ARG活力和血淋巴UA、UR含量呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng),同時(shí)XDH mRNA表達(dá)水平大小為肝胰臟>肌肉>鰓絲,ARG活力為鰓>肌肉>血淋巴>肝胰臟,UR含量為肝胰臟>鰓>血淋巴>肌肉(微量)。這說明三疣梭子蟹在氨氮脅迫下機(jī)體可能存在嘌呤合成尿酸途徑,可合成少量的尿酸,而鰓絲中受到顯著抑制;同時(shí)機(jī)體鳥氨酸-尿素循環(huán)途徑在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)未受到抑制,主要在鰓、肝胰臟中合成尿素,可通過排泄器官和鰓將尿素、尿酸排出體外,血淋巴UA、U