AKAP150錨定PKC信號在高糖致心肌損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病(Diabetes mellitus,DM)及其誘發(fā)的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥累及全身多個(gè)組織器官,具有高發(fā)病率,高致死率的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅了人類的健康。糖尿病與心血管疾病的關(guān)系十分密切,目前心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的首要原因。其中,高糖致心肌損傷是糖尿病嚴(yán)重心血管并發(fā)癥之一。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的慢性高血糖環(huán)境可導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能異常改變,并可進(jìn)一步進(jìn)展為糖尿病心肌病,增加心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),糖尿病心肌損傷也是

2、心肌缺血易損性增高的重要原因,糖尿病患者發(fā)生心血管事件的預(yù)后明顯差于非糖尿病患者。明確高糖導(dǎo)致心肌損傷的機(jī)制,尋求高糖狀態(tài)下心肌保護(hù)的新靶點(diǎn),對于降低糖尿病心源性死亡率具有重要意義。
　　以往研究表明,糖尿病心肌損傷的發(fā)病機(jī)制中多以蛋白激酶C(Prote in k inase C,PKC)的激活為共同通路。PKC過度激活促使心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激加劇,鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,心肌細(xì)胞凋亡增加,最終導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)異常和收縮功能障礙。然而,高糖狀態(tài)下

3、PKC激活及下游信號調(diào)控的具體分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。A型激酶錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins,AKAPs)是激酶調(diào)節(jié)蛋白家族成員,通過和多種激酶結(jié)合增強(qiáng)激酶的功能,從而起到調(diào)節(jié)信號通路的作用。最初發(fā)現(xiàn)AKAPs與蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)結(jié)合,調(diào)節(jié)PKA活化而引起科學(xué)界的關(guān)注。多項(xiàng)研究表明,AKAPs通過與激酶特異性錨定結(jié)合,可明顯增強(qiáng)激酶下游信號傳遞速度和擴(kuò)增強(qiáng)度,同時(shí)能

4、增加激酶下游信號傳遞的準(zhǔn)確性。目前AKAPs的正常生理功能及在多種疾病中的作用越來越受到關(guān)注。其中,AKAP79/150由AKAP5基因編碼(在人體內(nèi)為AKAP79,在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)為AKAP150),能與PKA、PKC、鈣調(diào)磷酸酶等蛋白錨定結(jié)合,調(diào)控cAMP、鈣離子、磷脂酶等信號通路活性。在動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),AKAP79/150可介導(dǎo)PKC的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位激活過程,并偶聯(lián)激活膜上離子通道L-type Ca2+ channel,發(fā)揮調(diào)

5、控血管張力重要作用。然而目前尚無研究報(bào)道AKAP79/150在高糖心肌損傷中的作用。
　　據(jù)此,本課題擬從整體動(dòng)物和細(xì)胞水平探討AKAP150是否參與高糖致心肌損傷,AKAP79/150對PKC信號可能的錨定調(diào)控及其分子機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.動(dòng)物及細(xì)胞水平明確高糖致心肌損傷的特點(diǎn),以及AKAP150表達(dá),PKC活性的改變;
　　2.動(dòng)物及細(xì)胞水平明確AKAP150在高糖致心肌損傷中的作用。
　　3

6、.細(xì)胞水平闡明AKAP150介導(dǎo)糖尿病心肌損傷的機(jī)制,即AKAP150特異性錨定激活PKCα、β亞型,調(diào)控PKC/p47phox/ROS信號加重心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡;調(diào)控PKC/PLB/SERCA信號導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常升高導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
　　研究方法:
　　1.選取體重為220-250 g雄性 SD大鼠,大鼠腹腔注射 S TZ溶液(35 mg/k g/d),連續(xù)注射3天。7d后取大鼠尾靜脈血,全自動(dòng)血糖儀監(jiān)測血糖

7、水平,以2次隨機(jī)血糖水平≥16.7 mmo l/L鑒定造模成功。
　　2.分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,使用25 mmo l/L葡萄糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞模擬高糖環(huán)境。
　　3.運(yùn)用心肌組織內(nèi)注射AKAP150腺病毒shRNA及培養(yǎng)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染AK AP150腺病毒shRNA的方法,以降低心肌AKAP150蛋白表達(dá)水平。
　　4.運(yùn)用小動(dòng)物超聲檢測大鼠心功能。
　　5.運(yùn)用TUN EL法、Caspase3活性測定、流式細(xì)胞術(shù)方法

8、檢測心肌組織及心肌細(xì)胞凋亡。
　　6.運(yùn)用超氧化物試劑盒、超氧離子探針及脂質(zhì)氧化試劑盒檢測心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。
　　7.運(yùn)用NADPH氧化酶活性檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞NADPH氧化酶活性。
　　8.運(yùn)用Fluo-3 AM試劑盒檢測心肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度。
　　9.運(yùn)用非放射性蛋白激酶C活性試劑盒檢測心肌細(xì)胞PKC活性。
　　10.運(yùn)用SERC A2 ELISA試劑盒檢測心肌細(xì)胞S ERC A2活性。

9、>　　11.運(yùn)用RT-PCR檢測心肌組織及心肌細(xì)胞AKAP150,PKC,p47phox,NF-κB mRNA水平。
　　12.運(yùn)用Western blot法檢測心肌組織及心肌細(xì)胞AKAP150,PKC,p47phox,NF-κB,PLB的表達(dá)或磷酸化水平。
　　13.運(yùn)用免疫熒光染色和免疫共沉淀方法檢測心肌細(xì)胞AKAP150與PKC的結(jié)合和共定位。
　　研究結(jié)果:
　　1.與正常大鼠相比,糖尿病大鼠心臟舒張功能

10、顯著降低,心肌細(xì)胞凋亡顯著增多。與正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞相比,高糖培養(yǎng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞ROS水平、凋亡顯著增多及胞漿鈣離子濃度異常升高。糖尿病大鼠心肌組織及高糖培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞AKAP150,PKC表達(dá)及PKC活性明顯升高,PKC的下游分子p47phox、p65NF-κB表達(dá)及活性也顯著升高。
　　2.降低心肌內(nèi)AKAP150表達(dá)可改善糖尿病導(dǎo)致的心臟舒張功能障礙,減少心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.降低心肌細(xì)胞AKAP150表達(dá)可減輕心肌細(xì)

11、胞氧化應(yīng)激水平和心肌細(xì)胞凋亡,抑制NADPH氧化酶活性,并降低心肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度。
　　4.降低AKAP150表達(dá)后高糖培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞PKC活性顯著降低,p47phox,NF-κB活性顯著降低。
　　5.降低AKAP150表達(dá)后高糖培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞PLB和SERCA2活性顯著上升。
　　6.免疫熒光及免疫共沉淀結(jié)果顯示:高糖培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞 PKC生成增多并由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位,與AKAP150共定位結(jié)合。而降低AK

12、AP150表達(dá)后,PKC膜轉(zhuǎn)位減少,AKAP150與PKC結(jié)合顯著降低。
　　7.免疫熒光結(jié)果顯示:高糖培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞AKAP150與PKCα、β亞型結(jié)合,而非PKCγ,且PKCα、β特異性抑制劑能夠降低高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞的ROS水平,凋亡和胞漿鈣離子濃度。
　　研究結(jié)論:
　　1.糖尿病導(dǎo)致心肌舒張功能不全,心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和胞漿鈣離子濃度升高,其機(jī)制可能與高糖增加心肌細(xì)胞內(nèi)AKAP150表達(dá)及PKC活性有關(guān);