PKC-βⅡ激活在糖尿病大鼠心肌微血管損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病與心血管疾病的密切關(guān)系得到了研究者的廣泛關(guān)注。當(dāng)糖尿病患者發(fā)生心血管事件而給予血管再通治療時(shí)再灌注事件發(fā)生率增高，證明了缺血再灌注(ischemic reperfusion I/R)在糖尿病病人的易損性，也即糖尿病病人在發(fā)生缺血性心臟病后心肌細(xì)胞死亡數(shù)量、心功能損傷程度及再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病缺血性心臟病患者。糖尿病患者發(fā)病后最常出現(xiàn)的病理損傷即是糖尿病微血管并發(fā)癥，可以累及多個(gè)器官，出現(xiàn)

2、復(fù)雜多樣的臨床表現(xiàn)，但多數(shù)研究顯示其病理基礎(chǔ)殊途同歸，都與微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷有關(guān)。這些現(xiàn)象給予研究者提示：糖尿病患者缺血再灌注損傷加重可能與發(fā)生缺血事件前即存在心臟微血管功能損害有關(guān)。
　　糖尿病微血管并發(fā)癥早期的病理損害主要是內(nèi)皮細(xì)胞連接破壞，細(xì)胞屏障功能降低，使損傷性因子在血管內(nèi)外的交換加速，損害血管功能并加重血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，此種病理現(xiàn)象在視網(wǎng)膜、腎臟、心臟組織中均廣泛存在，其病理機(jī)制認(rèn)為在高血糖或糖尿病狀態(tài)下PKC

3、激活，特別是其亞基PKC-βII的激活在血管損傷中起到至關(guān)重要的作用。PKC通路的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變及血管功能的障礙而促使糖尿病微血管病變的發(fā)生和發(fā)展。高度選擇性PKC-β抑制劑Ruboxistaurin(Rx)的應(yīng)用使PKC-βII激活在糖尿病微血管病變發(fā)生中作用的研究更為深入。但PKC-βII激活與心肌微血管屏障功能變化的病理關(guān)系研究尚少，具體機(jī)制還沒有得到明確肯定的結(jié)果。而PKC-βII激活是否在糖尿病缺血再灌注后微血管

4、損傷中也具有重要作用，尚未見報(bào)道。本課題擬分別從動(dòng)物和細(xì)胞水平觀察PKC-βII激活在糖尿病大鼠心肌微血管屏障功能變化中的作用及PKC-βII激活對(duì)糖尿病大鼠心肌微血管I/R損傷的影響，選擇性PKC-β抑制劑在此病理過程中的重要保護(hù)作用。
　　研究目的：
　　1．建立糖尿病大鼠模型，明確糖尿病大鼠心臟組織是否存在PKC-βII激活，PKC-βII激活與糖尿病大鼠心肌微血管內(nèi)皮通透性變化及細(xì)胞連接病理性破壞的聯(lián)系；
　　

5、2．建立糖尿病大鼠心臟I/R模型，觀察糖尿病大鼠I/R后心肌微血管損傷特點(diǎn)，并驗(yàn)證PKC-β抑制劑是否具有保護(hù)作用，從而證明PKC-βII激活參與糖尿病大鼠I/R后心肌微血管損傷的病理機(jī)制；
　　3．在高糖培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中觀察高糖作用下單層心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化及PKC-βII激活影響屏障功能的機(jī)制；
　　4．在體外模擬高糖培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中觀察單層心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬I/R后，細(xì)胞屏

6、障功能的變化及PKC-β抑制劑預(yù)處理后的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)PKC-βII激活參與高糖環(huán)境心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞I/R后損傷的病理機(jī)制。
　　研究方法：
　　1．選取體重120-150g雄性SD大鼠，高脂飼料喂養(yǎng)8w，腹腔注射50mg/kgSTZ，以2次隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L認(rèn)為糖尿病模型成功。
　　2．戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉大鼠，行左側(cè)開胸術(shù)，制備心肌缺血/再灌注大鼠模型。大鼠心臟缺血30min，

7、再灌注72h。
　　3．以硝酸鑭為示蹤劑透射電鏡下檢測(cè)糖尿病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，以樹脂(Mercox，SPI)灌注心臟，掃描電鏡下觀察微血管鑄型。
　　4．免疫熒光方法檢測(cè)糖尿病大鼠心臟組織PKC-βII及VE-cadherin的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)缺血再灌注后心臟Phospho-LIMK2表達(dá)。
　　5．八道生理記錄儀記錄缺血再灌注前后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)±LVdp/dtmax差值(缺血后±LVdp/dtmax－缺

8、血前±LVdp/dtmax)變化。
　　6．硫黃素S染色檢測(cè)缺血再灌注后糖尿病大鼠心臟無復(fù)流面積。利用硫黃素S使血管損傷無復(fù)流區(qū)血管不著色，計(jì)算心肌無復(fù)流面積。
　　7．無菌分離成年大鼠左心室組織，去除內(nèi)外膜及冠脈組織，心肌剪為1mm3組織塊，經(jīng)酶消化，條件培養(yǎng)及細(xì)胞純化后獲得心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　8．用InVitroVascularPermeabilityAssayKit檢測(cè)單層心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。

9、　　9．Westernblot方法檢測(cè)糖尿病大鼠心臟組織及培養(yǎng)細(xì)胞中PKC-βII，VE-cadherin，phospho-β-catenin及缺血再灌注后心臟組織及培養(yǎng)細(xì)胞中phospho-LIMK2的表達(dá)。
　　10．TUNEL染色檢測(cè)組織和培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。以CD31，TUNUL和DAPI三染的方式來計(jì)算缺血再灌注72h后糖尿病大鼠CMECs凋亡指數(shù)。
　　11．FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色CMECs細(xì)胞骨架

10、F-actin，熒光顯微鏡下觀察。
　　12．以G-actin/F-actinassaykit定量測(cè)定F-actin的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1．糖尿病大鼠心臟組織PKC-βII激活改變心肌微血管屏障功能。
　　（1）檢測(cè)空腹血糖水平升高驗(yàn)證成功制備了糖尿病大鼠模型。
　?。?）免疫熒光顯示糖尿病大鼠心臟組織PKC-βII激活及VE-cadherin排列紊亂，給予Rx治療后，PKC-βII激活減少、VE

11、-cadherin的表達(dá)維持連續(xù)。
　　（3）Westernblot結(jié)果證實(shí)糖尿病大鼠心臟PKC-βII（1.06±0.09vs.0.76±0.06，P<0.01）及phospho-β-catenin（0.74±0.13vs.0.47±0.11,P<0.01）表達(dá)較非糖尿病大鼠增加。Rx治療可下調(diào)PKC-βII（0.79±0.10vs.0.97±0.11，P<0.05）及Phospho-β-catenin(0.59±0.07vs.

12、0.80±0.11,P<0.05)表達(dá)。
　?。?）硝酸鑭顆粒示蹤電鏡觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌微血管屏障功能破壞，掃描電鏡觀察Mercox灌注發(fā)現(xiàn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接不完整，而Rx治療可有明顯改善。
　　2．PKC-βII激活參與糖尿病大鼠I/R后心肌微血管損傷加重的發(fā)生機(jī)制。
　　（1）糖尿病大鼠缺血再灌注前后±LVdp/dtmax差值增加，I/R對(duì)心功能損傷加重，給予Rx治療可保護(hù)糖尿病大鼠心功能。
　　（2

13、）糖尿病大鼠I/R后心臟無復(fù)流面積明顯大于假手術(shù)組(20.0±1.7％vs.0％)及非糖尿病組(20.0±1.7％vs.14.3±1.8％,P<0.01),Rx治療可降低糖尿病大鼠無復(fù)流面積(16.4±1.9％vs.19.4±1.6％,P<0.05)。
　　（3）糖尿病大鼠I/R心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞病理損傷加重，腫脹和空泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。Rx治療具有保護(hù)作用。
　　（4）糖尿病大鼠I/R后CMECs凋亡指數(shù)明顯高于假手術(shù)組（12.6

14、±2.2％vs.4.8±1.0％，P<0.01）及非糖尿病對(duì)照組（12.6±2.2％vs.7.8±0.8％,P<0.01）,Rx治療可降低CMECs凋亡指數(shù)（9.5±1.5％vs.12.2±2.1％,P<0.05）。（5）Phospho-LIMK2表達(dá)在糖尿病組明顯高于假手術(shù)（1.01±0.10vs.0.66±0.11,P<0.01）及非糖尿病對(duì)照組（1.01±0.10vs.0.60±0.09,P<0.01）,Rx治療降低Phospho

15、-LIMK2表達(dá)（0.76±0.08vs.0.97±0.10,P<0.01）。
　　3．高糖培養(yǎng)單層心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞PKC-βII激活，屏障功能降低。
　　（1）FITC-Dextran檢測(cè)高糖培養(yǎng)基中CMECs單層細(xì)胞通透性較普通培養(yǎng)基增加(394.50±36.92vs.282.10±14.93,P<0.01)。加入不同濃度Rx(1,10,100nmol/L)預(yù)處理后，單層細(xì)胞通透性明顯降低(P<0.01)。
　　

16、（2）高糖培養(yǎng)CMECsPKC-βII(1.17±0.13vs.0.71±0.07,P<0.01)，phospho-β-catenin(0.92±0.11vs.0.56±0.07,P<0.01)表達(dá)增高，Rx（10nmol/L）預(yù)處理細(xì)胞可降低PKC-βII及phospho-β-catenin表達(dá)(P<0.01)。VE-cadherin（c-19）蛋白總量無明顯變化。
　　4．PKC-βII激活參與高糖環(huán)境心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞SI/

17、R后損傷加重的病理機(jī)制。
　　（1）高糖培養(yǎng)單層細(xì)胞經(jīng)歷SI/R后通透性較Sham組(590.40±34.38vs.359.20±22.80,P<0.01）及普通低糖培養(yǎng)基組(590.40±34.38vs.383.70±37.58,P<0.01）顯著增加，Rx（10nmol/L）預(yù)處理后，通透性可明顯降低(432.00±30.83vs.571.10±32.60,P<0.01）。
　?。?）高糖培養(yǎng)CMECs給予SI/R后Ph

18、ospho-LIMK2表達(dá)明顯高于Sham組（1.11±0.09vs.0.31±0.09，P<0.01）及普通低糖培養(yǎng)基組（1.11±0.09vs.0.43±0.15，P<0.01），Rx預(yù)處理可降低Phospho-LIMK2表達(dá)（0.60±0.08vs.1.28±0.11，P<0.01）。
　?。?）高糖培養(yǎng)基CMECsAI明顯高于Sham組(13.3±1.3％vs.5.7±1.4％,P<0.01）及普通低糖培養(yǎng)基(13.3±1

19、.3％vs.7.8±0.8％,P<0.01）。Rx預(yù)處理后AI明顯降低(9.1±1.1％vs.12.8±1.8％,P<0.01）。
　?。?）高糖培養(yǎng)基中F-actin/G-actin較Sham組(10.73±1.32vs.6.58±1.34,P<0.01）及普通培養(yǎng)基組(10.73±1.32vs.7.73±0.97,P<0.01）增高。給予Rx預(yù)處理后F-actin/G-actin可降低（7.32±1.02vs.10.24±1.

20、38,P<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1．應(yīng)用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠證實(shí)糖尿病狀態(tài)可激活心臟PKC-βII表達(dá)，出現(xiàn)以微血管屏障功能降低為主要表現(xiàn)的病理改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)phospho-β-catenin表達(dá)增加，VE－cadherin排列紊亂可能參與病理機(jī)制。
　　2．糖尿病大鼠心臟缺血再灌注后心功能損害加重，心肌無復(fù)流面積增加，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性惡化、凋亡增加。這一系列的病理變化與糖尿病大鼠PKC-βII激活

21、誘導(dǎo)I/R時(shí)Rho激酶異常激活，LIMK2磷酸化增加有關(guān)；
　　3．高糖可致培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PKC-βII激活，從而使黏附連接蛋白β-catenin發(fā)生磷酸化改變，VE-cadherin-catenin連接復(fù)合體破壞是CMECs通透性增加，屏障功能損害的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；
　　4．培養(yǎng)于高糖環(huán)境的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞PKC-βII激活，SI/R后誘導(dǎo)Rho-Kinase異常激活，使LIMK2磷酸化表達(dá)增加，受其調(diào)控的下游分子F