PKC-TGF-β1-p38MAPK信號傳導(dǎo)通路及FN表達(dá)在糖尿病大鼠肺損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種代謝性疾病,隨著人們生活水平的提高和環(huán)境變化,其并發(fā)癥的發(fā)病率逐年增高。目前人們對糖尿病并發(fā)癥的研究主要致力于對心、腎、視網(wǎng)膜病變機(jī)制的研究,而對肺臟的研究相對較少。高糖經(jīng)蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路激活、二酰甘油(Diacylglycerol,DAG).蛋白激酶C(Protein KinaseC,PKC)通路及氧化應(yīng)激等途徑導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子-β(tran-sforming g

2、rowth factor-β,TGF-β)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase,MAPK)的激活,MAPK活化增多又可TGF-β1相互作用影響纖維連接蛋白(fibronectin,FN)。PKC處于細(xì)胞內(nèi)多條信號通路中心,構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)重要的信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),參與體內(nèi)很多生理病理過程。DAG-PKC途徑的活化是糖尿病肺損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。TGF-β信號在諸如纖維化、癌變、心腦血管疾病等許多重要疾

3、病的病理變化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。TGF-β是一類多功能的細(xì)胞調(diào)控肽,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有3種亞型,分別稱為TGF—β1,TGF-β2,TGF-β3。TGF-β1已經(jīng)被證實(shí)與很多肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)病變相關(guān)。TGF-β1的活化可使MAP K表達(dá)活性增強(qiáng)。MAPK通路是細(xì)胞將信號從細(xì)胞膜傳遞到核的主要通路,它是細(xì)胞促增殖和傳遞應(yīng)激信號的關(guān)鍵激酶。該家族包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular si

4、gnal—regulatedkinase,ERK)、c-Jun氨基端激酶(c-JunN—terminal kinase,JNLK)、p38MAPK等亞族,其中有實(shí)驗(yàn)資料表明p38MAPK在糖尿病肺損傷的形成及發(fā)展中起著非常重要的作用。p38MAP K可為DM多種致病因素的共同信號通路的交匯點(diǎn)。本研究應(yīng)用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法復(fù)制糖尿病大鼠模型觀察:1、糖尿病組大鼠肺泡隔增寬,肺間質(zhì)增加,部分肺泡

5、腔萎縮甚至塌陷；肺泡毛細(xì)血管扭曲。2、免疫組織化學(xué)法檢測肺組織PKC、TGF-β1、FN的表達(dá)變化,并對其進(jìn)行平均光密度分析；3、RT-PCR半定量檢測肺組織p38 MAPKmRNA的表達(dá)。以明確糖尿病肺組織中PKC、TGF-β1、FN、p38M APK的關(guān)系,探討PKC—TGF-β1-p38MAPK信號傳導(dǎo)通路及FN的表達(dá)對糖尿病大鼠肺損傷的作用及機(jī)制,為糖尿病肺損傷的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:1、實(shí)驗(yàn)性大鼠分組及

6、糖尿病模型的復(fù)制:60只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對照組(N)及糖尿病模型組(DM)組,每組各30只。DM組大鼠按60mg/kgSTZ溶液一次性腹腔注射,正常對照組腹腔注射等量上述的枸櫞酸緩沖液。72h后尾靜脈采血測定空腹血糖及定性尿糖,空腹血糖≥16.7mmol/L,尿糖定性≥+++,動(dòng)物多飲、多食和尿量增加者確定為DM模型。飼養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)組和對照組均給予相同的飲食和水。其間未用過包括胰島素在內(nèi)的任何治療,分別在實(shí)驗(yàn)第4

7、周、8周末處死大鼠各10只取材。
　　 2、血糖及體重測定:采用強(qiáng)生One TouchⅡ型血糖儀,在禁食12小時(shí)后,取大鼠尾末稍毛細(xì)血管全血測定空腹血糖。并用天平稱重大鼠體重、均為每周一次。
　　 3、留取肺組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色、光鏡下觀察肺組織病理改變。
　　 4、糖尿病大鼠肺組織免疫組化分析:對正常對照組及糖尿病組大鼠肺組織切片,進(jìn)行免疫組化染色。比較不同病程各組大鼠肺組織中PKC、TGFβ—1、FN的蛋白染

8、色情況,采用捷達(dá)JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的平均光密度,并對各組的均值進(jìn)行組間比較。
　　 5、糖尿病大鼠肺組織p38MAPK的基因表達(dá):取-80℃保存的新鮮肺組織100mg,利用Trizol一步法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增目的基因p38MAPK,利用β-actin作為內(nèi)參照,1.5％瓊脂糖凝膠電泳后應(yīng)用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)經(jīng)行灰度測量,結(jié)果取目的基因與內(nèi)參照的比值進(jìn)行半定

9、量分析。
　　 結(jié)果:1、糖尿病組大鼠血糖較同期對照組明顯升高、體重明顯下降(p<0.01)；
　　 2、HE染色組織學(xué)發(fā)現(xiàn):糖尿病組大鼠肺泡隔增寬,肺間質(zhì)增加,部分肺泡腔萎縮甚至塌陷；肺泡毛細(xì)血管扭曲。
　　 3、組織免疫化學(xué)染色發(fā)現(xiàn):糖尿病組大鼠肺組織PKC蛋白表達(dá)量顯著上調(diào),與TGF-β1、FN蛋白表達(dá)進(jìn)行性增多相平行,并隨著病程延長逐漸增多。
　　 4、p38MAPK mRNA表達(dá)糖尿病組比正常組

10、明顯增多,統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。
　　 結(jié)論:1、模型組大鼠血糖顯著升高,體重顯著下降,糖尿病模型復(fù)制成功。
　　 2、糖尿病組大鼠肺泡隔增寬,肺間質(zhì)增加,部分肺泡腔萎縮甚至塌陷；肺泡毛細(xì)血管扭曲。同時(shí)大鼠肺組織中TGF-β1、FN蛋白表達(dá)均增加,證實(shí)糖尿病肺組織存在纖維化改變。
　　 3、糖尿病大鼠肺組織PKC表達(dá)顯著升高,促進(jìn)TGF—β1與其受體結(jié)合,誘導(dǎo)TGF-β1-p38MAPK信號傳導(dǎo)通路中的TGF-β1、p3