ERK信號通路在缺鋅致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、鋅是人體必需微量元素,具有維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能、維持細(xì)胞正常形態(tài)、生長和發(fā)育等多種生物學(xué)作用,其中鋅與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制研究備受關(guān)注。本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,探討了在缺鋅致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中MEK/ERK信號通路及其表觀遺傳修飾的變化。主要完成了以下幾方面工作:
　　1、探討了缺鋅對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡的影響。原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞分為4組。即Control組(不加任何處理因素)、TPEN組

2、(2μmol/LTPEN作用24h)、TPEN+5μmol/LZn組(同時加入2μmol/LTPEN及5μmol/L的ZnSO4作用24h)和TPEN+50μmol/LZn組(同時加入2μmol/LTPEN及50μmol/L的ZnSO4作用24h)。觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率、壞死率、凋亡率及細(xì)胞上清液LDH活性的變化;應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)2μmol/LTPEN

3、作用24h后,海馬神經(jīng)存活率明顯降低,與對照組相比,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn均可顯著抑制TPEN誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率降低,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(2)2μmol/LTPEN作用24h后,海馬神經(jīng)細(xì)胞上清液中LDH活性明顯升高,與對照組相比,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn均能夠明顯降低細(xì)胞上清液中LDH活性,與TPEN組比較,

4、差異具有顯著性(P<0.05)。(3)2μmol/LTPEN作用24h后,海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死率、凋亡率明顯增加,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn均可明顯降低海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死率及凋亡率,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(4)2μmol/LTPEN作用24h可明顯抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá),與對照組相比,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μ

5、mol/LZn均明顯抑制TPEN誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)降低,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(5)2μmol/LTPEN作用24h后,海馬神經(jīng)細(xì)胞Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);聯(lián)合應(yīng)用5μmol/LZn或50μmol/LZn均能明顯抑制Bax及Caspase-3蛋白表達(dá),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。
　　2、探討了

6、缺鋅對海馬神經(jīng)細(xì)胞MEK/ERK通路的影響。實驗分組同上。采用Westernblot技術(shù)檢測MEK/ERK信號通路的關(guān)鍵信號分子Raf-1、pMEK及pERK蛋白表達(dá)。采用RT-PCR檢測了MEK/ERK信號通路上游信號分子NMDA受體的mRNA表達(dá);熒光分光光度法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i及ROS水平。采用Westernblot技術(shù)檢測MEK/ERK信號通路下游信號分子CREB的磷酸化水平、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示

7、:(1)用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞24h后,Raf-1、pMEK及pERK蛋白表達(dá)均明顯下降,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn均明顯抑制TPEN誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞Raf-1、pMEK及pERK蛋白表達(dá)的降低,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(2)用2μmol/LTPEN處理海馬神經(jīng)細(xì)胞24h,可明顯促進(jìn)NMDA三種亞型中NR1及NR2BmRNA的表達(dá),抑制

8、NR2AmRNA的表達(dá),與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn均明顯抑制TPEN誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞NR1及NR2BmRNA表達(dá)的上調(diào)及NR2AmRNA表達(dá)的下調(diào),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(3)用2μmol/LTPEN處理海馬神經(jīng)細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i及ROS水平明顯升高,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);聯(lián)合應(yīng)用5μmol/LZn或50μm

9、ol/LZn均能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i及ROS水平升高,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(4)用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞24h,可明顯抑制pCREB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá),與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);聯(lián)合應(yīng)用5μmol/LZn或50μmol/LZn均能明顯促進(jìn)pCREB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。
　　3、探討了MEK

10、/ERK信號通路激動劑NGF及抑制劑U0126對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞分為3組,分別是:(1)TPEN組:2μmol/LTPEN處理海馬神經(jīng)細(xì)胞24h。(2)TPEN+U0126組:用10μmol/LU0126預(yù)孵育海馬神經(jīng)細(xì)胞30min,再用TPEN處理24h。(3)TPEN+NGF組:用100ng/mlNGF預(yù)孵育海馬神經(jīng)細(xì)胞30min,再用TPEN處理24

11、h。采用Hochest染色的方法檢測細(xì)胞凋亡率;WesternBlot技術(shù)檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)用U0126預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞后,TPEN誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加了1.8倍;用NGF預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞后,TPEN誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降了1.4倍,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(2)U0126預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞,可顯著促進(jìn)Caspase-3蛋白的表達(dá);NGF預(yù)處理

12、海馬神經(jīng)細(xì)胞,則可顯著抑制Caspase-3蛋白的表達(dá),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(3)U0126和NGF預(yù)處理對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。
　　4、探討了缺鋅對海馬神經(jīng)細(xì)胞表觀遺傳修飾的影響。實驗分為Control組、TPEN組(2μmol/LTPEN)、TPEN+5μmol/LZn組和TPEN+50μmol/LZn組,處理同前。采用免疫酶學(xué)法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)HDAC的活性

13、;RT-PCR的方法檢測DNMT1、DNMT3a及DNMT3b以及組蛋白去乙?；窰DAC1、HDAC2及HDAC3mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞24h,HDAC活性明顯升高,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);5μmol/LZn和50μmol/LZn能夠顯著抑制TPEN誘導(dǎo)的HDAC活性的升高,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(2)用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞2

14、4h后,HDAC2mRNA的表達(dá)明顯增加,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);而聯(lián)合應(yīng)用5μmol/LZn或50μmol/LZn能夠顯著抑制HDAC2mRNA的表達(dá),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05);用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞24h,對HDAC1及HDAC2mRNA表達(dá)無明顯影響,與對照組比較,差異無顯著性(P>0.05)。(3)用2μmol/LTPEN處理神經(jīng)細(xì)胞24h后,DNMT1mRNA的表達(dá)明

15、顯增加,DNMT3amRNA的表達(dá)明顯降低,與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05);而DNMT3bmRNA的表達(dá)無明顯變化。
　　5、探討了MEK/ERK信號通路對海馬神經(jīng)細(xì)胞組蛋白去乙?；挠绊憽嶒灧譃門PEN組、TPEN+U0126組、TPEN+NGF組,處理同前。采用免疫酶學(xué)法檢測細(xì)胞核內(nèi)HDAC的活性;RT-PCR技術(shù)檢測HDAC2mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)U0126預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞,可明顯增加TPEN誘導(dǎo)

16、的HDAC活性升高,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05);NGF預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞,則可顯著抑制TPEN誘導(dǎo)的HDAC活性的升高,與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。(2)U0126預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞,可顯著促進(jìn)HDAC2mRNA的表達(dá);NGF預(yù)處理海馬神經(jīng)細(xì)胞,則可顯著抑制HDAC2mRNA的表達(dá),與TPEN組比較,差異具有顯著性(P<0.05)。
　　綜上所述,MEK/ERK信號通路表達(dá)異常及其組蛋白