川崎病動物模型的建立以及其血漿N末端腦利鈉肽前體水平的變化.pdf

1、目的
　　川崎病(Kawasakidisease,KD)是兒科一種常見的自身免疫性疾病,可引起全身性血管炎,并好發(fā)于冠狀動脈,從而造成嚴(yán)重的并發(fā)癥冠狀動脈損害(coronaryarteriallesions,CAL),是構(gòu)成兒童后天性心臟病的主要病因之一。目前,臨床上對于KD主要根據(jù)臨床特點,和輔以超聲心動圖檢查予以診斷,缺乏便于早期診斷的特異性生化指標(biāo),本課題通過建立動物疾病模型,對其血液相關(guān)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測,以期尋找到一種可幫

2、助疾病早期診斷的血液指標(biāo)。同時,KD的發(fā)病機(jī)制至今也尚不明確,疾病動物模型的建立也可為進(jìn)一步探討KD的發(fā)病機(jī)制提供研究平臺。
　　方法
　　第一階段:本課題采用乳酸桿菌細(xì)胞壁提取物(1actobacilluscaseicellwallextract,LCWE)作為免疫誘導(dǎo)劑,通過MRS肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)獲取大量培養(yǎng)物,并經(jīng)超聲破碎、SDS細(xì)胞裂解,以及RNase、DNaseI、胰蛋白酶等處理萃取所需LCWE,最終以細(xì)胞壁

3、中肽聚糖的含量作為LCWE的濃度,利用多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚生成橙黃色化合物(苯酚-硫酸法),在紫外可見分光光度計波長490nm下檢測其吸光度,并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物葡萄糖胺所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得到LCWE的樣品濃度,然后配制成濃度為1mg/ml的溶液備用。
　　第二階段:將80只BALB/C小鼠(4-6周齡)隨機(jī)分為實驗組和對照組,每組各40只,對實驗組小鼠采取腹腔注射LCWE(1mg/ml

4、)0.5ml,連續(xù)3天,而對照組小鼠則予以生理鹽水NS作同樣處理。然后于第1、3、5、10、28天對兩組小鼠分批進(jìn)行解剖,每次各組解剖8只,摘取心臟、主動脈等血管組織,對組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色,觀察其病理改變。另外,通過摘眼球法采血留取血液標(biāo)本0.5-1ml,經(jīng)離心后,采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定小鼠血漿N末端腦鈉肽前體(N-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NT-proBN

5、P)的含量,并對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,比較兩組小鼠NT-proBNP濃度的變化是否具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　結(jié)果：
　　1、動物組織標(biāo)本病理變化情況:經(jīng)腹腔注射LCWE后,實驗組小鼠心臟冠狀動脈及主動脈等血管周圍發(fā)生炎性改變的占77.5％(31/40),而對照組小鼠則未有發(fā)生類似血管炎癥改變現(xiàn)象。
　　2、實驗組小鼠心臟及主動脈標(biāo)本經(jīng)HE染色后光鏡下檢查顯示起初僅見有少許中性粒細(xì)胞沿著血管內(nèi)皮聚集,后

6、逐漸增多累及血管壁周圍(第1、3天),繼之出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的浸潤,同時伴有血管內(nèi)膜增厚(第5天),第10天炎癥反應(yīng)累及血管全層,可見動脈內(nèi)膜、中膜以及外膜斷裂,并伴有大量巨噬細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生,至28天時,血管周圍炎性細(xì)胞明顯減少,出現(xiàn)明顯纖維化,導(dǎo)致動脈血管增厚狹窄。
　　3、小鼠血漿NT-proBNP的含量變化:兩組BALB/C小鼠的血液經(jīng)離心后,采用ELISA法檢測其血漿NT-p

7、roBNP濃度,并對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗,發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠NT-proBNP濃度明顯升高,與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。同時,結(jié)合所得的實驗數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠血漿NT-proBNP濃度在疾病發(fā)展的急性期(第1～10天)有逐漸升高趨勢,至第28天實驗組小鼠血漿NT-proBNP濃度水平相對于初期又出現(xiàn)明顯下降,而對照組小鼠血漿NT-proBNP濃度水平則未見有明顯波動變化。
　　結(jié)論
　　1.腹腔注射LCWE能夠誘