不同殺菌劑對根尖外多細菌生物膜作用的體外研究.pdf

1、根尖周病是口腔臨床的常見病,目前最有效的治療方法是根管治療術(shù),其原理是清除根管系統(tǒng)內(nèi)的感染,從而促進根尖周病變組織的愈合。臨床中有一些由于解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、感染微生物種類特殊等原因會導(dǎo)致根管治療失敗,這些病例絕大多數(shù)可以通過根管再治療術(shù)或根尖外科手術(shù)得到解決。其中,某些病例出現(xiàn)根尖外的微生物感染,形成根尖外生物膜,就必需通過根尖切除倒充填的外科手術(shù)方法進行治療。為了能夠徹底去除根尖外生物膜,根尖外科手術(shù)要求切除根尖約3mm的牙體組織,這樣勢

2、必會影響牙齒的抗力。能否采用物理、化學(xué)的手段(非機械切除)清除根尖外生物膜,從而達到既能清除感染,又能最大限度地保留牙體組織的目的呢?
　　國內(nèi)外學(xué)者往往將這種通過根管治療、甚至再治療都難以控制的根尖周病稱為難治性根尖周病,研究表明衣氏放線菌、血液鏈球菌、糞腸球菌均為革蘭陽性兼性厭氧菌,在難治性根尖周病的根尖生物膜內(nèi)能夠檢出,放線菌能造成慢性的根尖放線菌病,血鏈球菌是牙周和心臟疾病中常見的細菌。糞腸球菌的耐受力和抵抗性強,所以在難

3、治性根尖周病中亦是常見菌,在臨床切除的根尖組織或拔除的患牙根尖部的微生物學(xué)研究結(jié)果顯示,難治性根尖周病往往根尖外生物膜是以這三種細菌為主的混合細菌生物膜。
　　強酸性電解質(zhì)水(SAEW)、次氯酸鈉(NaClO)、洗必泰(CHX),是臨床根管治療中常用的根管內(nèi)消毒溶液,強酸性電質(zhì)水是電離分解鹽水得到,生物相容性較好。次氯酸鈉是有很強殺菌并破壞分解細菌和有機物質(zhì)的化學(xué)藥品,廣泛的在根管沖洗中使用。洗必泰和次氯酸鈉能力相似,但殺菌作用稍

4、弱,在漱口水的成分中?？梢姷?。人β防御素-3(rHBD-3)為一種宿主防御肽,是新型的殺菌藥物,可殺滅多種細菌,特別是耐藥菌,但作為殺菌液使用的報道還不多。這幾種殺菌劑雖然有報道能分別殺滅或抑制體外單獨培養(yǎng)的上述三種細菌,次氯酸鈉、洗必泰和強酸性電解質(zhì)水還能有效清除根管內(nèi)的生物膜,那么它們和新型的人β防御素-3能否清除根尖外生物膜,尤其是三種細菌混合的根尖外生物膜呢?迄今為止仍鮮見報道。因此,我們試圖探索三種細菌共培養(yǎng)的體外模式,建立根

5、尖牙骨質(zhì)上三種細菌的混合生物膜,并觀察次氯酸鈉、洗必泰和強酸性電解質(zhì)水以及人β防御素-3對根尖牙骨質(zhì)上混合細菌生物膜的作用,為難治性根尖周病的治療提供新的臨床思路。研究分兩部分:
　　一根尖多細菌生物膜的培養(yǎng)
　　先將三種細菌,血鏈球菌、糞腸球菌、衣氏放線菌,分別在1/2牛心腦浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基中中進行共同培養(yǎng),觀察三種細菌形成的菌落間是否有相互抑制。之后將三種菌接種在96孔板上,結(jié)晶紫染色觀察生物膜的生

6、長情況取96孔板將置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)48h用結(jié)晶紫染色法觀察單菌種生物膜成膜情況,分別于培養(yǎng)后24、48、54、56、58、70、76、82、94、106小時,每個時間點終止培養(yǎng),用三蒸水沖洗3次后每孔加入250μl的乙醇溶液固定30min;固定結(jié)束后棄原液,分別用1g/L結(jié)晶紫染色5min;330ml/L冰醋酸洗去染液后,用酶標儀分別測定570nm波長處的OD值,觀察生物膜的生長曲線。三種細菌共同在根尖牙骨質(zhì)片上培養(yǎng)5天后

7、,用25ml/L戊二醛溶液在4℃固定過夜,500ml/L、600ml/L、750ml/L850ml/L、950ml/L、1000ml/L乙腈梯度脫水、干燥、噴金、掃描電鏡觀察并拍照。以上實驗提示三種不同的細菌可以共同良好的生長,接菌順序和方法會對其生長有一定影響。
　　二不同殺菌液對多細菌生物膜作用的研究
　　在上一實驗的基礎(chǔ)上,對接種好的牙骨質(zhì)片和細胞爬片分別用強酸性電解質(zhì)水(SAEW)、不同濃度(5g/L和10g/L)次

8、氯酸鈉(NaClO)溶液、(50mg/L、100mg/L、800mg/L)抗菌肽(rHBD-3)溶液、(2g/L、10g/L、20g/L)洗必泰(CHX)溶液,處理15秒、1分鐘和5分鐘,52.5g/LNaClO溶液和生理鹽水分別為陽性對照和陰性對照;各組處理結(jié)束后。樣本固定干燥、脫水、噴金后進行掃描電鏡觀察;另外用活死菌染色劑處理,激光共聚焦顯微鏡下觀察殺菌效果,并用ImageJ軟件分析各組的殺菌效率。各實驗組和陽性對照組在各處理時間

9、點的活菌比例均顯著低于陰性對照組(P<0.05),其中SAEW/15s組,5g/L/NaClO15s、1min、5min組,10g/L/NaClO15s、1min組,50、100、800mg/L/rHBD-3/15s、1min、5min組的活菌比例均明顯高于陽性對照組(P<0.05);而SEAW,10g/L次氯酸鈉、20g/L洗必泰1min、5min處理組與52.5g/L次氯酸鈉溶液各時間段處理組相比活菌比例均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05