不同防腐劑對副溶血弧菌生物膜抑制和清除作用的研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）是嗜鹽性、革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海水、河口環(huán)境中，特別是海鮮類和鹽漬類的產(chǎn)品中，是一種重要的食源性致病菌，可引起食物中毒和急性腹瀉病。生物膜是微生物細胞及其產(chǎn)生的細胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細菌群落，它也是細菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致持續(xù)感染的重要方式。生物膜一旦形成，使用一般的抗生素、消毒劑很難去除，在醫(yī)療和食品安全等領(lǐng)域帶來很大的風險。因此，開發(fā)天然的、安全的

2、抗生物膜制劑具有重要的意義。
　　本研究采用結(jié)晶紫染色法、平板菌落計數(shù)、微量肉湯二倍稀釋法、XTT減量法、苯酚-硫酸法、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察等方法，分析不同條件下副溶血弧菌生物膜的形成特性和食品防腐劑處理對生物膜的抑制和清除作用。研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.以副溶血弧菌標準菌株ATCC17802、J5421以及實驗室分離鑒定得到的24株副溶血弧菌作為研究對象，分析其形成生物膜的能力，結(jié)果21號菌株和22號

3、菌株成膜能力較強。選擇副溶血弧菌ATCC17802、J5421和21號、22號菌株為研究對象，分析不同菌株、時間、溫度、pH、鹽濃度、材料等因素對生物膜的形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間為2 d時，四株菌的成膜能力均最高。pH在5～9時有利于副溶血弧菌生物膜形成。高濃度的NaCl有利于副溶血弧菌ATCC17802、J5421、22號菌株生物膜的形成，其中添加3％的NaCl時生物膜形成量最高；低濃度的NaCl有利于副溶血弧菌21號菌株生物膜

4、的形成，其中添加1.5%的NaCl生物膜形成量最高。比較四種不同的材料（玻片、不銹鋼片、蟹殼、魚鱗）上副溶血弧菌粘附能力，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌在蟹殼上粘附能力最強。
　　2.進一步研究殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸（ε-PL）對副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖對副溶血弧菌的抑菌能力最強，其MIC和MBC分別為1.25 mg/mL和2.5 mg/mL；經(jīng)過1/2MIC、1/4MIC、

5、1/8MIC殼聚糖溶液處理后，其抑制率分別為68.37%、34.12%、14.38%；菌體的代謝活性抑制率分別為47.74%、34.34%和17.17%；胞外多糖抑制率為76.32%、62.57%和29.38%。結(jié)果表明亞抑菌濃度下的殼聚糖能夠明顯抑制生物膜的形成，降低細菌的代謝活性。經(jīng)1/2MIC殼聚糖+1/4MIC山梨酸鉀+1/2MIC脫氫乙酸鈉+1/4MICε-聚賴氨酸復(fù)配后對生物膜的抑制率達到79.54%，菌體的代謝活性抑制率為

6、59.72%，胞外多糖抑制率為85.44%。亞抑菌濃度的防腐劑之間復(fù)配顯著增強了單獨使用一種防腐劑對生物膜的抑制效果。
　　3.分析研究了殼聚糖、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和ε-聚賴氨酸（ε-PL）對副溶血弧菌ATCC17802和J5421菌株生物膜的清除作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4MIC、2MIC、MIC殼聚糖溶液處理4 h后，其清除率分別達到86.94%、61.43%、46.94%；菌體的代謝活性減少率分別為76.10%、63.11%、52

7、.20%；胞外多糖減少率為81.43%、69.63%、61.12%。結(jié)果表明殼聚糖對副溶血弧菌的清除效果最強，隨著殼聚糖濃度的增加以及作用時間的延長，殼聚糖對副溶血弧菌生物膜的清除作用顯著增強。高濃度的殼聚糖可以有效的清除成熟的生物膜。進一步通過4MIC殼聚糖+MIC山梨酸鉀+2MIC脫氫乙酸鈉+2MICε-聚賴氨酸復(fù)配大大增強了清除成熟生物膜的效果。防腐劑復(fù)配對成熟生物膜的菌體殺菌率為96.34%，代謝活性減少率為85.64%，胞外多