外周血Treg細胞及NKG2D+NK細胞表達在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　研究統(tǒng)計，近年來結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)一直是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率位居前三的惡性腫瘤之一，每年全球都有數(shù)百萬新發(fā)病例及約600，000人死于結(jié)直腸癌。隨著飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢。由于結(jié)直腸癌早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時已屬中晚期。目前結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸機理仍不明確，對于喪失手術(shù)時機的結(jié)直腸癌患者仍缺乏更有效的治療方法。因此

2、，尋找理想的結(jié)直腸癌早期診斷和預(yù)后評價指標(biāo)以及理想的治療靶點十分必要。
　　自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是機體重要的先天免疫效應(yīng)細胞，能清除體內(nèi)的腫瘤細胞、被病毒或細菌感染的細胞等，發(fā)揮天然免疫監(jiān)視功能。NK細胞表面存在多種活化性和抑制性受體，其細胞毒作用的發(fā)揮就依賴于各種活化和抑制信號的綜合。NKG2A(Natural-killer group 2，member A)是NK細胞表面的一種重要的抑制性受體，特

3、異性識別和結(jié)合其配體HLA-E，向NK細胞傳遞抑制信號。NKG2D(Natural-killer group 2，member D)是NK細胞表面的一種主要的活化性受體，特異性識別和結(jié)合其配體MICA/B、ULBPs后，向NK細胞傳遞活化信號。多項研究表明，NKG2D介導(dǎo)的NK細胞毒作用下降可能是造成腫瘤細胞免疫逃逸的原因之一。
　　調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是機體重要的免疫抑制性細胞，可抑制

4、CD8+CTL細胞、NK細胞及樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)等多種免疫效應(yīng)細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素。目前天然CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞是研究最為深入的一類Treg細胞。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Fork head box protein 3，F(xiàn)oxp3)是Treg細胞最關(guān)鍵的細胞內(nèi)標(biāo)志物，對于Treg細胞的分化和功能維持具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞在結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等患者外周血

5、和腫瘤局部微環(huán)境中比例增高，且Treg細胞水平與患者腫瘤進展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān);在腫瘤切除后Treg細胞恢復(fù)到正常水平，而腫瘤復(fù)發(fā)時Treg細胞增多。
　　研究報道，Treg細胞可以通過細胞接觸依賴機制(cell-contact-dependantmechanism)及分泌轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β、IL-10等免疫抑制性細胞因子抑制NK細胞的活化，從而使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。然而，

6、Treg細胞與NK細胞受體NKG2A、NKG2D在結(jié)直腸癌中的表達、相互關(guān)系及臨床意義尚不明了。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，為了深入認(rèn)識Treg細胞、NK細胞及其受體NKG2A與NKG2D表達在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義，以便為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的思路和實驗依據(jù)，本研究確定研究目的及研究方法如下。
　　研究目的:
　　1.觀察CRC患者外周血中NK細胞抑制性受體NKG2A及活化性受體NKG2D在mRNA水平及蛋白水平

7、的表達情況。
　　2.觀察封閉純化NK細胞受體NKG2D表達對NK細胞毒作用及脫顆粒作用的影響。
　　3.觀察CRC患者外周血中Treg細胞水平及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的關(guān)系。
　　4.平行測定CRC患者外周血中Treg細胞水平、NKG2D+NK細胞水平及血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)水平，評價它們的相關(guān)性。
　　研究方法:
　　1.患者與對照CRC患者97例（

8、男52例，女45例）收自山東省立醫(yī)院胃腸外科。所有患者的確診根據(jù)衛(wèi)生部頒布的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)(2010)，并排除合并糖尿病、腎病、肝病或其它自身免疫性疾病，標(biāo)本收集前均未接受放、化療。健康對照48例（男26例，女22例）收自山東省立醫(yī)院健康查體中心。本課題得到山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。
　　2.細胞與細胞培養(yǎng)抽取研究個體15mL抗凝靜脈血，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(perip

9、heral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用免疫磁珠方法陰性分選NK細胞，流式細胞術(shù)測定CD3-CDC6+NK細胞純度達95％。獲得的NK細胞在含10％滅活胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、1％青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入100U/mL重組人白介素(recombinant human interkin，rIL)2，在37℃及5％CO2孵箱中孵育。
　　人結(jié)腸癌細

10、胞株HT29作為靶細胞，在含10％滅活FCS、1％青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃及5％CO2孵箱中孵育。2-3天更換1次培養(yǎng)基，細胞在使用前洗2次。
　　在抗體封閉試驗中，NK細胞先與不同濃度抗NKG2D中和抗體孵育30min，然后與靶細胞HT29共同孵育，之后進行細胞毒試驗及CD107a脫顆粒試驗。
　　3.實時定量PCR總RNA根據(jù)廠家說明書用TRIzol試劑從PBMCs中提取。提取的總RNA的濃度和質(zhì)

11、量由測定的吸光度A260及A260/A280比率評價。反轉(zhuǎn)錄體系(20μL)包括:1μ總RNA，2μL的Maxima enzyme mix，4μL的5×PCRmix。反轉(zhuǎn)錄程序如下:25℃10min，55℃30min，85℃5min。獲得的cDNA在用于PCR擴增前作10倍稀釋。
　　引物包括:CD94，NKG2A，NKG2D及β-actin。PCR反應(yīng)體系(20μL)包括:5μL的cDNA，5μL的0.8μM上下游引物，10μL

12、的2×PCRmix。擴增程序如下:95℃5min，然后45個循環(huán):95℃15sec，60℃30see，72℃15sec。用96孔板在羅氏Light Cycler480序列測定系統(tǒng)上合成PCR產(chǎn)物。最后，將PCR產(chǎn)物電泳以評價是否合成了要求的產(chǎn)物。
　　4.流式細胞術(shù)NKG2A和NKG2D檢測屬于表面抗原檢測，用10μL抗人CD3抗體，5μL抗人CD56抗體，10μL抗人NKG2A抗體，10μL抗人NKG2D抗體對PBMCs染色，同

13、時使用同型對照。
　　Treg細胞用調(diào)節(jié)性T細胞試劑盒參照廠家說明書測定。對于表面抗原染色，在100μL全血中加入10μL抗人CD4抗體和10μL抗人CD25抗體，4℃避光孵育30min。然后室溫加入1×RBCLysisBuffer溶解紅細胞。對于細胞內(nèi)抗原染色，需要先破壞細胞膜，在細胞中加入fixation/permeabilization working solution，避光孵育60min。然后加入10μL抗人Foxp3抗體

14、染色。同時使用同型對照抗體。
　　對于CD107a脫顆粒測定，將NK細胞與HT29在37℃混合培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為200μL，然后每孔加入10μL抗人CD107a抗體。37℃孵育1h后，加入1.7μL莫能霉素(0.1mg/mL)，再孵育3h。同時設(shè)對照孔。收集細胞后，再加入10μL抗人CD3抗體及5μL抗人CD56抗體進行表面抗原染色。
　　用EPICSXL流式細胞儀(Beckman Coulter)或BDFACSⅡ流式細胞儀(

15、BD Biosciences)至少計數(shù)10，000個細胞。
　　5.細胞毒測定采用51Cr釋放試驗，純化NK細胞作為效應(yīng)細胞，HT29作為靶細胞。HT29與51Cr同位素在37℃孵育1h。被標(biāo)記的靶細胞與NK細胞以不同效靶比共孵育4h。收集上清，用γ-counter(Packard CobraⅡ5002)分析。計算51Cr釋放百分率。自發(fā)性釋放應(yīng)小于最大釋放的15％。
　　6.血清CEA測定非特異性腫瘤標(biāo)志物CEA作為CRC

16、患者的診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷指標(biāo)，在我院生化室采用羅氏Cobase601系統(tǒng)檢測。在健康人群中，CEA的參考范圍是0-10ng/L。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析采用Graph Pad Prism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。ttest用于比較2個組之間的可數(shù)變量結(jié)果。one-way Anova用于比較3或4組之間的可數(shù)變量。Spearman correlation analysis用于判斷2個變量之間的相關(guān)性。p＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意

17、義。
　　結(jié)果:
　　1.CRC患者外周血NKG2A在mRNA水平、蛋白水平及NK細胞表面的表達水平均與健康對照相似;而NKG2D在mRNA水平、蛋白水平及NK細胞表面的表達水平均顯著低于健康對照。
　　2.用抗NKG2D中和抗體封閉NKG2D路徑后，NK細胞毒作用及CD107a脫顆粒均隨著抗NKG2D中和抗體濃度的增加而降低。
　　3.NKG2A和NKG2D也可以在NKT細胞及T細胞上表達。但NKG2A在外周血

18、NK細胞、NKT細胞及T細胞上的表達依次降低;NKG2D在外周血T細胞上的表達顯著低于NK細胞和NKT細胞。
　　4.CRC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞均比健康對照顯著升高，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期不相關(guān)。
　　5.在CRC患者和健康對照外周血中，CD4+CD25highFoxp3+細胞水平均顯著高于CD4+CD25lowFoxp3+細胞水平。
　　6.CR

19、C患者上調(diào)的CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞水平與下調(diào)的NKG2D+NK細胞水平無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。
　　7.CRC患者CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞水平與血清CEA水平之間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，盡管一些嚴(yán)重的進展期CRC患者Treg細胞和血清CEA同時增高。
　　結(jié)論:
　　結(jié)直腸癌患者抑制性受體NKG2A和活化性受體NKG2

20、D在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的表達失衡，可能與NK細胞活性抑制相關(guān)。我們推論CRC腫瘤細胞可以經(jīng)由NKG2路徑逃避NK細胞免疫監(jiān)視;然而，其潛在的機制需要進一步探究。CRC患者外周血免疫抑制性Treg細胞表達顯著增高，而外周血NKG2D+NK細胞表達顯著降低，但均與CRC患者是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期不相關(guān)。受到研究樣本量的限制，在上調(diào)的Treg細胞與下調(diào)的NKG2D+NK細胞之間我們未發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性;在Treg細胞與血清CEA水平