蛋白磷酸酶5(PP5)對(duì)小鼠脂肪代謝及骨發(fā)育的影響.pdf

1、蛋白磷酸酶5（protein phosphatase5，PP5）是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移以及脅迫條件下細(xì)胞的生存等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) PP5基因敲除小鼠的體重較野生型輕，體型也較小。進(jìn)一步以PP5基因敲除小鼠（PP5KO）為模型，較為深入地研究了PP5在脂肪代謝和骨發(fā)育中的作用。首先對(duì)高脂飼養(yǎng)WT和PP5 KO小鼠體重進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)，MRI檢測(cè)小鼠體內(nèi)脂肪的分布，HE和油紅O染色

2、對(duì)小鼠肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)和組織化學(xué)分析，利用體外誘導(dǎo)WT和KO小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast cells，MEF）脂肪分化，利用western blotting和realtime-PCR研究了PP5基因?qū)χ痉只爸x相關(guān)通路基因的調(diào)控。同時(shí)為探究PP5在骨分化方面的作用，首先對(duì)WT和KO小鼠的體重及股骨長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量分析；利用HE染色、CT掃描分別對(duì)WT和KO小鼠股骨組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析；利用

3、生物力學(xué)儀檢測(cè)了WT和KO小鼠股骨應(yīng)力的差異；利用體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells，MSC）成骨分化、利用siRNA干擾前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 PP5基因的表達(dá)，研究PP5對(duì)骨分化的影響；利用western blotting、realtime-PCR和免疫組化技術(shù)研究了PP5基因?qū)前l(fā)育調(diào)控通路相關(guān)基因的調(diào)控。主要結(jié)果如下：
　　1.與WT對(duì)照小鼠相比，高脂飼喂的PP5 KO小鼠體重顯

4、著減輕且體重增加顯著變慢；肝臟中脂滴數(shù)量顯著減少，且脂滴較??；CT掃描顯示PP5 KO小鼠體內(nèi)脂肪積累顯著少于WT對(duì)照組。
　　2.通過(guò)體外誘導(dǎo)MEF細(xì)胞脂肪分化，發(fā)現(xiàn)與WT MEF細(xì)胞相比，PP5 KO MEF細(xì)胞脂肪分化明顯減弱，同時(shí)形成的脂滴較小。
　　3.real time PCR檢測(cè)PP5 KO小鼠肝臟組織中脂肪分化標(biāo)記基因：脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid importer cluster of differe

5、ntiation36，CD36）、AP2、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptorγ2，PPARγ2）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucose transporter4，GULT4）的相對(duì)表達(dá)量與WT小鼠相比顯著降低；western blotting的結(jié)果表明PP5 KO小鼠肝臟組織中磷酸化糖皮質(zhì)激素受體（phosphorylation glucocorticoid r

6、eceptor，p-GR）和解耦聯(lián)蛋白1（uncoupling protein1，UCP1）蛋白表達(dá)量顯著高于WT小鼠。
　　4.在骨發(fā)育方面，與WT小鼠相比，PP5 KO小鼠體重顯著減輕、股骨變短、變粗，骨小梁數(shù)量增加、骨小梁分離度變小、骨小梁厚度變大，相對(duì)骨體積（股骨中骨成分的體積/股骨的總體積）增大、骨密度顯著增大，皮質(zhì)骨厚度增加，骨相對(duì)表面積（股骨中骨成分的表面積/骨體積）減少，利用生物力學(xué)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PP5 KO小鼠股骨最

7、大載荷顯著減小，說(shuō)明PP5基因敲除后小鼠骨分化增強(qiáng)但是股骨承重能力顯著減弱。
　　5.體外誘導(dǎo)骨分化實(shí)驗(yàn)表明，與WT骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，PP5 KO間充質(zhì)干細(xì)胞體外骨分化顯著增加。
　　6. real time PCR結(jié)果顯示，PP5 KO小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及軟骨中骨分化相關(guān)基因：骨橋蛋白（osteopontin，Opn）、骨鈣素（osteocalcin，Ocn）、成骨轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcri

8、ption factor2，Runx2)相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而骨分化抑制基因(peroxisome proliferator activated receptorγ1，PPARγ1)和（peroxisome proliferator activated receptorγ2，PPARγ2）相對(duì)表達(dá)量顯著降低；免疫組化結(jié)果顯示Runx2蛋白表達(dá)量顯著升高，PPARγ蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性變化；利用 western blotting檢測(cè) PP5