HOXA11在胃癌中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控及其在Wnt信號(hào)通路中的功能研究.pdf

1、背景:胃癌(Gastric cancer)在全世界惡性腫瘤死亡病因中位居第二僅次于肺癌,其術(shù)后五年生存率仍然較低,因此尋找胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物,對(duì)提高胃癌早期診斷率非常重要。雖然遺傳學(xué)的異常改變?cè)谀[瘤發(fā)生中扮演重要角色,但是其不足以解釋胃癌的發(fā)生機(jī)制。隨著人們對(duì)表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入,表觀遺傳在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用越來(lái)越受到人們的重視。同源盒基因A11(homeobox-containing A11,HOXA11)是發(fā)育過(guò)程中

2、相對(duì)保守的一個(gè)基因,主要起到調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和增殖的作用。在卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均存在表達(dá)下調(diào)。但HOXA11的表觀遺傳學(xué)改變及其在胃癌中的作用目前尚不清楚。
　　目的:分析HOXA11在胃癌中的表觀遺傳學(xué)改變及其調(diào)控機(jī)制;探討HOXA11在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。結(jié)合病人的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析,探討HOXA11甲基化能否可能成為胃癌的早期診斷和預(yù)后的標(biāo)志物,并通過(guò)對(duì)HOXA11在胃癌中的功能研

3、究,探討HOXA11作為分子治療靶點(diǎn)的可能性。
　　材料與方法:對(duì)6株胃癌細(xì)胞系(AGS,NCI-N87,SGC7901,MGC803,BGC823,HGC27 and MKN45)應(yīng)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine、5-aza-dc)處理前后HOXA11的表達(dá)水平;應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)6株胃癌細(xì)胞系、5例正常胃粘膜和112例胃

4、癌組織標(biāo)本中HOXA11啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況,并應(yīng)用硫化測(cè)序方法驗(yàn)證三種不同甲基化狀態(tài)的細(xì)胞系胞嘧啶甲基化改變情況。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)方法分析HOXA11甲基化和胃癌臨床病理學(xué)特點(diǎn)的相關(guān)性,P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。采用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HOXA11對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOXA11對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)HOXA11轉(zhuǎn)染前后AGS細(xì)胞系基因表達(dá)改變情況。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)

5、道及基因芯片篩選結(jié)果,對(duì)HOXA11調(diào)控的下游靶基因,進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR和western blot進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和western blot方法,在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中,對(duì)HOXA11在下游信號(hào)通路的影響進(jìn)行分析。對(duì)現(xiàn)有的45例配對(duì)的石蠟包埋的胃癌和癌旁組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色(IHC)檢測(cè)HOXA11和磷酸化β-catenin表達(dá)水平,探討HOXA11和后者的相關(guān)性。
　　結(jié)果:六株胃癌細(xì)胞系中,AGS細(xì)

6、胞發(fā)生完全甲基化并且不表達(dá),經(jīng)甲基化酶抑制劑5-aza處理后,HOXA11恢復(fù)表達(dá),MGC803和SGC7901是部分甲基化,其表達(dá)水平減低,經(jīng)甲基化酶抑制劑5-aza處理后,HOXA11的表達(dá)水平升高。NCI-N87,BGC823,HGC27 and MKN45呈非甲基化狀態(tài),甲基化酶抑制劑5-aza處理前后表達(dá)水平無(wú)變化。以上結(jié)果表明,HOXA11的表達(dá)在胃癌中受甲基化調(diào)控。112例原發(fā)性胃癌HOXA11的甲基化率為81.25％(9

7、1/112),5例正常胃粘膜組織均為非甲基化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明HOXA11甲基化與性別、腫瘤組織大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色表明HOXA11和磷酸化β-catenin在腫瘤組織標(biāo)本中表達(dá)缺失或下調(diào)。MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HOXA11轉(zhuǎn)染組較空載組細(xì)胞增殖減慢,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表明恢復(fù)HOXA11表達(dá)細(xì)胞處于G2/M阻滯狀態(tài),細(xì)胞呈早期凋亡狀態(tài)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步顯示HOXA11可以抑制細(xì)胞遷移能力,同時(shí)用腫

8、瘤細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)(transwell assay)進(jìn)一步驗(yàn)證,結(jié)果表明HOXA11可以降低AGS細(xì)胞的惡性侵襲和遷移?；蛐酒Y(jié)果顯示,恢復(fù)HOXA11表達(dá)可以引起199個(gè)基因表達(dá)上調(diào),102個(gè)基因表達(dá)下調(diào),其中Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵基因NKD1表達(dá)上調(diào)4.94倍。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示恢復(fù)表達(dá)HOXA11可以抑制經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路的活性而導(dǎo)致下游靶基因的蛋白表達(dá)減低(如c-myc和cyclinD1)。