ERK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和表觀遺傳學(xué)調(diào)控在鑭所致仔鼠記憶損傷中的作用機(jī)制及關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　稀土元素(rare earth elements，REEs)由15個(gè)鑭系元素及其同族的鈧和釔組成。目前，REEs已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和現(xiàn)代生物醫(yī)藥等各個(gè)方面。隨著稀土技術(shù)的迅速的推廣和應(yīng)用，大量的REEs進(jìn)入到環(huán)境中，并通過食物鏈等途徑進(jìn)入機(jī)體并在其中蓄積，對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。研究表明，REEs能夠通過血腦屏障進(jìn)入腦組織并在其中蓄積，從而造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的損傷和認(rèn)知功能的異常。居住于

2、稀土礦區(qū)的兒童在智商均數(shù)、學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力等方面均較對(duì)照區(qū)兒童明顯低下。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，REEs可導(dǎo)致動(dòng)物CNS發(fā)育缺陷、學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　鑭是一種應(yīng)用廣泛的輕稀土元素，在環(huán)境介質(zhì)和食品中含量較高、在腦中蓄積性較強(qiáng)的REEs，其化學(xué)性質(zhì)十分活潑，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，故常被用作研究REEs神經(jīng)毒性的代表物質(zhì)。本課題組對(duì)鑭所致的CNS毒效應(yīng)及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鑭暴露可以使受試動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力和回避條件反射記憶明顯受

3、損。研究顯示，每天注射高劑量鑭可使雛雞的長(zhǎng)時(shí)記憶明顯受損，使大鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力下降。提示鑭損害生物體的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。而記憶的構(gòu)建和維持需要新的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。有證據(jù)表明，表觀遺傳學(xué)調(diào)控在突觸可塑性、記憶形成和鞏固相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者提出表觀遺傳學(xué)調(diào)控參與記憶的形成和突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用是通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂素活化蛋白激酶(

4、extracellular signal regulated kinase/mitogen activatedprotein kinase，ERK/MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來完成的。而環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)通過ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，并在突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)記憶（long-term memory, LTM）形成中的關(guān)鍵作用也得到了證實(shí)。同時(shí)，

5、CREB的靶基因產(chǎn)物如即早基因（immediate-early genes，IEGs)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophie factor，BDNF)等也在CNS發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用。因此我們推測(cè)，鑭有可能通過抑制ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化狀態(tài)，干擾表觀遺傳學(xué)調(diào)控，從而對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響。
　　在本研究中，我們從仔鼠出生后開始給予氯化鑭（lanthanum chloride，

6、LaCl3）染毒，至斷乳后兩個(gè)月結(jié)束，建立LaCl3染毒的子代動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用神經(jīng)行為學(xué)、分子生物學(xué)等方法探討鑭對(duì)ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及表觀遺傳學(xué)調(diào)控的影響，旨在闡明鑭染毒造成記憶損害的分子靶點(diǎn)與相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康Wistar大鼠80只，體重260±10g。將雌雄1∶1同籠進(jìn)行交配，次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者記為妊娠第0d，孕鼠單籠飼養(yǎng)并自由攝水。子代

7、大鼠出生后，隨機(jī)將雌鼠分為對(duì)照組（飲用蒸餾水）、低劑量染鑭組（飲用含0.25％LaCl3的蒸餾水溶液）、中劑量染鑭組（飲用含0.50％LaCl3的蒸餾水溶液）和高劑量染鑭組（飲用含1.0％LaCl3的蒸餾水溶液），每組20只動(dòng)物。仔鼠在斷乳前經(jīng)吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過飲水?dāng)z入鑭，至斷乳后2個(gè)月結(jié)束。染毒結(jié)束后進(jìn)行各種指標(biāo)測(cè)定:采用神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試方法測(cè)定仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，應(yīng)用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察仔鼠海馬神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu)變化，采用W

8、estern blot法對(duì)MEK1/2、ERK1/2、MSK1、CBP、BDNF、c-FOS的蛋白表達(dá)水平和MEK1/2、ERK1/2、MSK1、CREB的磷酸化水平以及組蛋白H3、H4的蛋白表達(dá)水平和乙?；竭M(jìn)行檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定仔鼠海馬hat、hdac1、hdac2、hdac3、hdac4、hdac6、hdac8、dnmt1、dnmt3a、dnmt3b、bdnf和c-fos的mRNA表達(dá)水平，采用MSP法測(cè)定bdnf和

9、c-fos啟動(dòng)子部位DNA甲基化情況。向仔鼠雙側(cè)海馬注射ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激動(dòng)劑forskolin和抑制劑U0126，然后用上述方法對(duì)其下游相關(guān)指標(biāo)及組蛋白乙?；揎椷M(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、氯化鑭對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力和突觸可塑性的影響
　　在Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中，LaCl3染毒組的仔鼠出現(xiàn)逃避潛伏時(shí)間和游泳距離顯著長(zhǎng)于對(duì)照組。在空間探索試驗(yàn)中LaCl3染鑭組在目標(biāo)象限的潛伏期和游泳距離均少

10、于對(duì)照組。各LaCl3染毒組仔鼠表現(xiàn)出進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)少于對(duì)照組，第一次進(jìn)入目標(biāo)象限的時(shí)間也長(zhǎng)于對(duì)照組。從搜索平臺(tái)的策略上看，LaCl3染毒組目標(biāo)不明確，搜索象限不正確，甚至是無序搜索。在穿梭箱試驗(yàn)中仔鼠被動(dòng)回避性條件反射的記憶能力明顯下降。兩項(xiàng)試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)攝入LaCl3損傷大鼠的長(zhǎng)時(shí)記憶，且損害作用的強(qiáng)度隨染鑭劑量增加而增強(qiáng)，具有正相關(guān)關(guān)系。表明鑭暴露大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力受損。LaCl3可引起海馬神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)的異常，使突觸活性帶變短、

11、突觸后致密物變薄、突觸界面曲率下降、突觸間隙減小。
　　2、氯化鑭對(duì)仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　LaCl3可引起仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯增加、導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡，由此可造成其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂。干擾記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活化和基因轉(zhuǎn)錄。LaCl3可抑制仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)p-MEK1/2、p-ERK1/2和p-MSK1的表達(dá)水平，導(dǎo)致CREB的磷酸化水平降低，

12、CBP蛋白表達(dá)水平、c-fos、bdnf的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。應(yīng)用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑U0126可加重鑭對(duì)于c-fos、bdnf mRNA轉(zhuǎn)錄和p-CREB、CBP、c-FOS、BDNF蛋白表達(dá)的抑制作用，而應(yīng)用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑forskolin可拮抗鑭的作用，使c-fos、bdnfmRNA轉(zhuǎn)錄和p-CREB、CBP、c-FOS、BDNF的蛋白表達(dá)水平得到一定程度的恢復(fù)。
　　3、氯化鑭對(duì)仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞

13、內(nèi)表觀遺傳學(xué)調(diào)控模式的影響
　　LaCl3可影響仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)調(diào)控模式，使hat mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)、使hdac2、hdac3、hdac6和hdac8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，導(dǎo)致Ac-Histone H3蛋白表達(dá)水平下降;LaCl3下調(diào)仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中dnmt3a mRNA轉(zhuǎn)錄水平、使c-fos基因啟動(dòng)子部位的非甲基化水平顯著降低，而甲基化水平顯著升高;還下調(diào)bdnf基因啟動(dòng)子部位的非甲基化水平，上調(diào)其甲

14、基化水平，由此抑制這兩個(gè)與記憶密切相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑U0126可加重鑭對(duì)于hat mRNA轉(zhuǎn)錄和Ac-Histone H3蛋白表達(dá)的抑制作用，hdac2、hdac3、hdac6和hdac8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步升高。而應(yīng)用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑forskolin可拮抗鑭的作用，使hat mRNA轉(zhuǎn)錄和Ac-Histone H3的蛋白表達(dá)水平得到一定程度的恢復(fù)，hdac2、hdac3、hdac6和

15、hdac8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、亞慢性LaCl3染毒可顯著降低仔鼠在Morris水迷宮試驗(yàn)和穿梭箱試驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力，使神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)異常。
　　2、LaCl3可引起仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯增加、導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡，由此可造成其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂，干擾記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活化和基因轉(zhuǎn)錄，這勢(shì)必會(huì)影響學(xué)習(xí)記憶功能。
　　3、LaCl3可抑制仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)

16、導(dǎo)通路，應(yīng)用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑U0126可加重鑭對(duì)于c-fos、bdnfmRNA轉(zhuǎn)錄和p-CREB、c-FOS、CBP、BDNF蛋白表達(dá)的抑制作用，而應(yīng)用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑forskolin可拮抗鑭的作用，使c-fos、bdnf mRNA轉(zhuǎn)錄和p-CREB、CBP、c-FOS、BDNF的蛋白表達(dá)水平得到一定程度的恢復(fù)。
　　4、LaCl3可引起表觀遺傳學(xué)調(diào)控紊亂，下調(diào)Histone H3乙酰化水平，使c-fos和bdnf啟