肝再生增強(qiáng)因子對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種來源于漿細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它的發(fā)生率在血液系統(tǒng)腫瘤中居第二位。MM的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子與骨髓瘤生長(zhǎng)的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子(TNF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-21(IL-21)等細(xì)胞因子在骨髓瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡和耐藥性產(chǎn)生等

2、方面起了很重要的作用，它們通過作用于特異的受體再活化JAK/STAT3、PI-3激酶/AKT、Ras/MAPK、NF-κ B、β-catenin旁路等幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞增殖。
　　我們課題組在利用BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和受免疫BALB/c小鼠的B淋巴細(xì)胞融合而成的雜交瘤細(xì)胞制備抗人肝再生增強(qiáng)因子(Augmenter of Liver Regeneration，ALR)單抗時(shí)偶然發(fā)現(xiàn):將能產(chǎn)生抗人ALR

3、單抗的雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，從而產(chǎn)生含高濃度抗人ALR單抗的腹水，我們進(jìn)行了多次制備，每次五只小鼠，然而讓人驚奇的是，每次總有2-3只小鼠在產(chǎn)生1-2輪腹水后，腹水自行消失，開腹檢查找不到任何接種雜交瘤細(xì)胞的痕跡。由此我們推測(cè)，骨髓瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生和分泌大量ALR，并且嚴(yán)重依賴ALR來維持其惡性生長(zhǎng)，由于小鼠的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗人ALR單抗中和了骨髓瘤細(xì)胞增殖依賴的ALR，導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞缺乏維持其惡性生長(zhǎng)的刺激信號(hào)而發(fā)生

4、凋亡，最終腹水自行消失。
　　肝再生增強(qiáng)因子是上世紀(jì)90年代初被克隆的一種新的熱穩(wěn)定性、非特異性促進(jìn)損傷肝臟修復(fù)的細(xì)胞因子，分子量約為15KD，其氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)均不同于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，它在體內(nèi)多種組織器官中有表達(dá)。目前對(duì)它的生物學(xué)作用研究主要局限于肝臟。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALR在體外能刺激肝癌細(xì)胞的增殖，且其促增殖效應(yīng)與ALR的濃度成正相關(guān)，但是ALR對(duì)原代肝細(xì)胞的增殖無刺激作用。實(shí)驗(yàn)證明ALR在肝癌組織中是

5、高表達(dá)的，而正常成人大多數(shù)肝細(xì)胞均不表達(dá)ALR，這些都提示ALR在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。我們課題組最新的研究（基金資助項(xiàng)目:30570826）也證明用ALR特異性單抗阻斷肝癌細(xì)胞分泌的ALR與其受體結(jié)合或用siRNA在轉(zhuǎn)錄水平阻止ALR表達(dá)，均能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖和移植瘤的生長(zhǎng)。
　　關(guān)于ALR在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其在多發(fā)性骨髓瘤增殖中的作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無任何研究報(bào)道。因此，我們以此為切入點(diǎn)，針對(duì)以上ALR是否參

6、與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的作用進(jìn)行研究，以期闡明ALR在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制，并為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的參考靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究主要分為三個(gè)部分:
　　第一部分:ALR在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266中的表達(dá)研究。
　　目的:通過對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266中ALR的mRNA和蛋白水平的檢測(cè)，證明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞高表達(dá)ALR，為進(jìn)一步探討ALR在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖中的作用奠定基礎(chǔ)。

7、　　方法:利用Realtime PCR檢測(cè)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266、小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞PMBC中ALR的mRNA表達(dá)水平;利用Western-blot檢測(cè)U266、SP2/0及PMBC細(xì)胞中ALR的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:Realtime PCR結(jié)果顯示人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266和小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0中ALR的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞PMBC。Western-bl

8、ot結(jié)果顯示U266、SP2/0細(xì)胞株中ALR蛋白表達(dá)水平較高，而PMBC組未見ALR蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266中，ALR mRNA及蛋白水平均為高表達(dá)。
　　第二部分:ALR對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266增殖及凋亡的影響研究。
　　目的:檢測(cè)外源性加入ALR及抗ALR單克隆抗體后U266細(xì)胞增殖情況;構(gòu)建表達(dá)ALR基因的shRNA干擾慢病毒，檢測(cè)沉默內(nèi)源性ALR后U266細(xì)胞增殖及凋亡情況。<

9、br>　　方法:利用臺(tái)盼藍(lán)染色初步觀察U266細(xì)胞株在分別加入外源性ALR和ALR單克隆抗體后的增殖情況，然后利用MTS法檢測(cè)不同濃度的ALR和ALR單抗對(duì)U266細(xì)胞株增殖的影響。接下來，構(gòu)建表達(dá)ALR shRNA干擾慢病毒，感染U266細(xì)胞株，在熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白(GFP)觀察感染效率，Real-time PCR檢測(cè)U266細(xì)胞株ALR mRNA水平，Western blot檢測(cè)U266細(xì)胞株ALR蛋白水平，觀察干擾效率。

10、通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、MTS法、Brdu滲入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)ALR shRNA慢病毒干擾ALR表達(dá)對(duì)U266增殖的影響。最后，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)U266細(xì)胞凋亡情況，Realtime PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)因子P53、Bax、Bcl-2、survivin變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、臺(tái)盼藍(lán)染色、MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性加入ALR能促進(jìn)U266細(xì)胞的增殖，且具有一定范圍內(nèi)的濃度一效應(yīng)關(guān)系，外源性加入抗ALR單克隆抗體能夠抑制U266

11、細(xì)胞的增殖。
　　2、成功構(gòu)建了表達(dá)ALR shRNA干擾慢病毒，熒光顯微鏡顯示shRNA干擾慢病毒能順利感染U266細(xì)胞株，其MOI值為1時(shí)，感染效率達(dá)80％。
　　3、Real-time PCR檢測(cè)表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株72h后ALR mRNA水平明顯降低，約為對(duì)照shRNA慢病毒組的20％左右;Western blot檢測(cè)表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株72h后ALR蛋白水平明顯降

12、低。
　　4、臺(tái)盼藍(lán)染色、MTS法、Brdu滲入實(shí)驗(yàn)均顯示表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株72h后，細(xì)胞增殖明顯受抑，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株72h后細(xì)胞凋亡明顯上升，Realtime PCR顯示凋亡相關(guān)因子Bax明顯上調(diào)，而Bcl-2明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、外源

13、性ALR能夠促進(jìn)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266的增殖。
　　2、外源性中和U266細(xì)胞自分泌的ALR，能夠抑制U266細(xì)胞的增殖。
　　3、表達(dá)ALR shRNA干擾慢病毒能夠內(nèi)源性沉默ALR的表達(dá)。
　　4、內(nèi)源性沉默ALR的表達(dá)能夠抑制U266細(xì)胞的增殖，并且通過影響凋亡相關(guān)因子Bax和Bc l-2來調(diào)控U266細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分:表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株后多個(gè)家族細(xì)胞因子變化情況

14、的研究。
　　目的:通過前兩部分我們證實(shí)了ALR對(duì)U266細(xì)胞株的促增殖和抗凋亡作用，本部分利用慢病毒轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞株沉默ALR基因表達(dá)后，ELISA法檢測(cè)與多發(fā)性骨髓瘤增殖和凋亡相關(guān)的多個(gè)家族細(xì)胞因子變化，篩選出可能與ALR蛋白表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞因子，從而為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:利用ELISA法分別檢測(cè)表達(dá)ALR shRNA慢病毒感染U266細(xì)胞株后細(xì)胞因子IL-6、IL-10、VEGF、TNF-α的水平。<