間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合復(fù)合支架構(gòu)建組織工程瓣膜的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：組織工程瓣膜種子細(xì)胞的研究
　　 目的：采用間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）構(gòu)建組織工程心臟瓣膜（TEHV），并對(duì)MSCs的細(xì)胞生物學(xué)，及所構(gòu)建TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能進(jìn)行研究。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs和肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞鑒定后分別種植于去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣葉支架上，然后在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV，并分別做為實(shí)驗(yàn)組A和B。對(duì)MSCs的細(xì)胞生物學(xué)，及兩組TEHV的生

2、物學(xué)和生物力學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：MSCs表達(dá)CD29 (94.82%)和CD44 (93.59%)。免疫組化和熒光染色檢測(cè)顯示MSCs的Vimentin 染色均為陽性，部分MSCs的α-SMA 染色陽性。實(shí)驗(yàn)組B的α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA表達(dá)均高于實(shí)驗(yàn)組A（P<0.05），而LOX蛋白含量和LOX mRNA表達(dá)均低于實(shí)驗(yàn)組A（P<0.05）。兩組TEHV的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)相似。實(shí)驗(yàn)組A 支架上MSCs

3、的Vimentin 染色均為陽性，部分MSCs的α-SMA 染色陽性。兩組TEHV的DNA和羥脯氨酸含量，最大負(fù)荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和彈性模量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：在采用MSCs 體外構(gòu)建TEHV 過程中，其細(xì)胞生物學(xué)性能與肌成纖維細(xì)胞相比存在差異，而兩者所構(gòu)建TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能相當(dāng)。這說明MSCs 構(gòu)建的TEHV 并沒有在性能方面體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。有必要通過其他方法，對(duì)MSCs 構(gòu)建的

4、TEHV 性能加以改善。
　　 第二部分：bFGF 調(diào)控組織工程瓣膜構(gòu)建的研究
　　 目的：探討堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）對(duì)MSCs 構(gòu)建的TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能的影響。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs，種植于去細(xì)胞瓣葉支架上。將支架置于含10 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)14 d 構(gòu)建的TEHV做為實(shí)驗(yàn)組A。實(shí)驗(yàn)組B 除培養(yǎng)液中不添加bFGF外，其余同實(shí)驗(yàn)組A。實(shí)驗(yàn)組C 為大鼠肌成纖維

5、細(xì)胞構(gòu)建的TEHV。對(duì)MSCs的細(xì)胞生物學(xué)，及各組TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組A和C的α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但均高于實(shí)驗(yàn)組B（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組A和C的LOX 蛋白含量和LOX mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但均低于實(shí)驗(yàn)組B（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組A 支架的再細(xì)胞化程度明顯優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B和C；DNA和羥脯氨酸含量

6、高于實(shí)驗(yàn)組B和C（P<0.05）。各組TEHV 生物力學(xué)性能的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：在采用MSCs 聯(lián)合bFGF 體外構(gòu)建TEHV 過程中，通過bFGF的調(diào)控作用，可以使MSCs的表型特性、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的表達(dá)增強(qiáng)，達(dá)到與肌成纖維細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃剑豢梢允筂SCs的LOX 蛋白和基因表達(dá)降低，達(dá)到與肌成纖維細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃剑豢梢蕴岣逿EHV的生物學(xué)性能。但bFGF 改善TEHV 生物力學(xué)性能的作用不

7、明顯。
　　 第三部分：組織工程瓣膜復(fù)合支架的研究
　　 目的：采用靜電紡絲技術(shù)制備復(fù)合支架，然后在支架上種植MSCs 構(gòu)建TEHV，并研究復(fù)合支架對(duì)TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能的影響。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs和肌成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組A 為豬主動(dòng)脈瓣葉經(jīng)去細(xì)胞處理后，在其表面涂鋪采用靜電紡絲技術(shù)制備的聚（3-羥基丁酸酯－co-4-羥基丁酸酯）（P3/4HB）纖維膜，構(gòu)建復(fù)合支架。實(shí)驗(yàn)組B和C 為去細(xì)胞豬

8、主動(dòng)脈瓣葉支架。在實(shí)驗(yàn)組A和B的支架上種植MSCs，在實(shí)驗(yàn)組C的支架上種植肌成纖維細(xì)胞，各組均在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV，并進(jìn)行生物學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：復(fù)合支架的整個(gè)P3/4HB 纖維膜結(jié)構(gòu)均一，平均直徑是156±3 nm，并且與去細(xì)胞瓣葉支架表面緊密結(jié)合。各組支架的再細(xì)胞化程度相當(dāng)，DNA和羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B、C 相比，最大負(fù)荷、最大應(yīng)力和彈性膜量明顯上升（P<0

9、.05），而最大應(yīng)變的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：復(fù)合支架能明顯增強(qiáng)TEHV的生物力學(xué)性能，而其對(duì)TEHV 生物學(xué)性能的改善作用不明顯。
　　 第四部分：間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合bFGF 復(fù)合支架構(gòu)建組織工程瓣膜的研究
　　 目的：采用MSCs 聯(lián)合bFGF 復(fù)合支架構(gòu)建TEHV，以改善TEHV的生物學(xué)和生物力學(xué)性能。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs。實(shí)驗(yàn)組A 為豬主動(dòng)脈瓣葉經(jīng)去細(xì)胞處理后，

10、在其表面涂鋪采用緩釋和靜電紡絲技術(shù)制備的含有bFGF 殼聚糖納米粒的P3/4HB 纖維膜，構(gòu)建復(fù)合支架（bFGF）。實(shí)驗(yàn)組B 為在去細(xì)胞瓣葉表面涂鋪P3/4HB 纖維膜，構(gòu)建復(fù)合支架。實(shí)驗(yàn)組C和D 為去細(xì)胞瓣葉支架。然后在各組支架上種植MSCs，實(shí)驗(yàn)組C 在含10 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其余各組均在不含bFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。各組均在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV。各組TEHV 進(jìn)行生物學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)

11、果：復(fù)合支架（bFGF）的載藥量為0.00077%，包封率為88.1%，累積釋放度為1d 約16.3%，5 d 約42.4%，10 d 約51.1%和15 d 約53.9%。復(fù)合支架（bFGF）的整個(gè)bFGF 殼聚糖納米粒P3/4HB 纖維膜結(jié)構(gòu)均一，并且與去細(xì)胞瓣葉支架表面緊密結(jié)合。實(shí)驗(yàn)組A和C 支架的再細(xì)胞化程度明顯優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B和D，DNA和羥脯氨酸含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組B和D（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組A和B與實(shí)驗(yàn)組C和D 相比，最大負(fù)荷