血友病B及血管性血友病分子發(fā)病機制研究.pdf

1、研究目的: 血友病B(hemophilia B，HB)是凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ，F(xiàn) Ⅸ)基因突變引起血漿FⅨ量的缺乏或質(zhì)的缺陷所導致的一種X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，在男性中的發(fā)病率約為1/30000，是一種嚴重危害人民健康的疾病。由于目前尚缺乏針對本病的根治措施，故開展基因診斷及攜帶者檢出無疑是防止新的患兒出生、阻斷有害基因傳遞、提高人口素質(zhì)的一個有效手段。本研究旨在從基因水平對HB患者及攜帶者做出診斷，探討HB的分子發(fā)病機制。

2、 方法: 1．采集3個無血緣關(guān)系的HB家系先證者及成員外周靜脈血，提取基因組DNA。 2．選擇距離FⅨ2cM內(nèi)的6個STR位點，采用多重PCR及熒光標記引物擴增各STR位點片段，檢測先證者及其家系成員6個STR位點的基因多態(tài)性，進行家系遺傳連鎖分析。 3．根據(jù)FⅨ基因序列，利用Primer 5軟件共設計8對引物，采用PCR法對先證者及可疑攜帶者FⅨ基因8個外顯子及其側(cè)翼序列進行擴增，運用雙脫氧鏈終止法在A

3、BI3700測序儀上對PCR產(chǎn)物進行測序，利用Chromas軟件將測序結(jié)果與正常序列進行比對，尋找基因突變。 結(jié)果: 1．聯(lián)合6個STR位點對3個HB家系進行檢測，根據(jù)先證者的基因型，共發(fā)現(xiàn)9名可疑攜帶者，她們均有一條與先證者同源的X染色體。但基因測序證實，家系1、3可疑攜帶者的FⅨ基因中并不存在與先證者相同的基因缺陷，結(jié)合先證者的臨床和病史特點，考慮其基因缺陷可能由自發(fā)性突變產(chǎn)生。家系2可疑攜帶者的FⅨ基因中發(fā)現(xiàn)了與先

4、證者相應位點相同的雜合突變，STR位點基因多態(tài)性檢測結(jié)果與基因測序結(jié)果一致，說明先證者的基因缺陷遺傳自其母親。 2．利用PCR法及基因測序技術(shù)，在3例先證者的FⅨ基因中均發(fā)現(xiàn)了相應的錯義突變：家系1先證者外顯子6發(fā)現(xiàn)G22119A(側(cè)翼序列的剪切位點)點突變，家系2先證者外顯子2發(fā)現(xiàn)G7932C(Glu8Asp)點突變，家系3先證者外顯子8發(fā)現(xiàn)T32685C(Cys336Arg)點突變。G22119A發(fā)生在外顯子6側(cè)翼序列的剪切

5、位點，使FⅨ不能被正常剪切，從而影響其正常生理功能。T32685C發(fā)生在外顯子8，該部位編碼絲氨酸蛋白酶催化區(qū)，存在FⅨ與FⅧ的結(jié)合位點，可能是由于氨基酸的改變影響了FⅨ蛋白在細胞內(nèi)的合成與分泌，導致FⅨ功能缺陷。G7932C發(fā)生在外顯子2，導致Glu突變?yōu)锳sp，影響了FⅨ與Ca2+依賴性磷脂的結(jié)合。 結(jié)論: 1．FⅨ基因缺陷是HB的分子發(fā)病機制。 2．聯(lián)合多個STR多態(tài)性位點對HB家系攜帶者進行間接診斷，是一