IL-31真核表達載體的構(gòu)建及其對HaCaT細胞的影響.pdf

1、目的:
　　(1)克隆人白細胞介素-31(hIL-31)cDNA序列,構(gòu)建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達載體。
　　(2)將構(gòu)建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達載體轉(zhuǎn)染COS-7細胞,篩選出穩(wěn)定表達hIL-31的細胞株,分離并純化hIL-31蛋白。
　　(3)使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細胞,探討其對IL-6、TNF-αmRNA和蛋白質(zhì)水平表達的影響。

2、>　　(4)使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細胞,探討其對細胞周期和細胞增殖的影響。
　　方法:
　　(1)采用淋巴細胞分離液分離獲得人外周血單核細胞,培養(yǎng)之后加入終濃度為20nmol/L的PMA,繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞。
　　(2)Tizol法提取細胞總RNA,RT-PCR擴增hIL-31cDNA序列,并將其構(gòu)建到真核表達載體pSecTag2/Hygro B上。
　　(3)使用DNA轉(zhuǎn)染試劑盒將構(gòu)建

3、成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31轉(zhuǎn)染至COS-7細胞當中,并使用潮霉素進行篩選,獲得單個克隆后進行擴大培養(yǎng),采用核酸蛋白檢測儀進行蛋白質(zhì)的分離與純化。
　　(4)使用不同濃度的hIL-31干預HaCaT細胞,采用Real-Time PCR的方法分析其對HaCaT細胞IL-6、TNF-αmRNA表達的影響;ELISA法檢測其對HaCaT細胞IL-6、TNF-α蛋白表達的影響;MTT法分析其對細胞增殖的影響以及流式細

4、胞儀檢測對細胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序分析鑒定,成功獲得hIL-31基因cDNA全長序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達載體。
　　(2)成功篩選出穩(wěn)定表達hIL-31的COS-7細胞株,并分離純化出IL-31蛋白。
　　(3)hIL-31能夠顯著誘導IL-6、TNF-αmRNA和蛋白水平的表達,并具有時間和劑量依賴效應。
　　(4)小劑量、短時間

5、的hIL-31抑制HaCaT細胞增殖的作用不明顯;高劑量、長時間的hIL-31對HaCaT細胞的增殖有一定的抑制作用。
　　(5)hIL-31可以改變HaCaT細胞周期,使得G1期細胞數(shù)量增加,S期和G2期細胞數(shù)量減少。
　　結(jié)論:
　　(1)IL-31可以促進HaCaT細胞IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平的表達。
　　(2)外源性的IL-31可以改變HaCaT的細胞周期,進而抑制細胞增殖,并且其效應具有時