IL-24突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建IL-24突變體(RGD-IL-24)真核表達(dá)載體，對(duì)比研究RGD-IL-24和野生型IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7，HeLa，Ketr-3及正常細(xì)胞NHLF的生長(zhǎng)抑制作用并初步探討其機(jī)制，為進(jìn)一步研究RGD-IL-24的體內(nèi)靶向抑瘤活性及其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)豐富了IL-24在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，為腫瘤靶向治療提供新思路。
　　 方法: 利用定位點(diǎn)突變技術(shù)，在IL-24基因序列精氨酸密碼子(AGA) 和天冬氨酸

2、密碼子(GAC)之間插入甘氨酸密碼子(GGT)，構(gòu)建含RGD膜序的IL-24突變體(RGD-IL-24)；將重組RGD-IL-24和IL-24分別插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1，通過(guò)酶切、測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒；培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人腎癌細(xì)胞Ketr-3和正常人肺成纖維細(xì)胞NHLF，分別用pCDNA3.1、pCDNA3.1/IL-24和pCDNA3.1/RGD-IL-24轉(zhuǎn)染四種細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

3、(RT-PCR) 檢測(cè)IL-24 mRNA表達(dá)；蛋白印跡 (Western blot) 檢測(cè)IL-24蛋白表達(dá)；MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖；FITC-annexin V染色檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡；Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡；Western blot檢測(cè)bax，bcl-2的表達(dá)和caspase 3的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1. 成功構(gòu)建IL-24突變體(RGD-IL-24)，并插入真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCD

4、NA3.1/RGD-IL-24，測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒序列與理論序列完全吻合。
　　 2. RT-PCR檢測(cè)IL-24 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24組均表達(dá)IL-24 mRNA，兩處理組mRNA表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3. Western blot檢測(cè)IL-24蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3

5、.1/IL-24組均表達(dá)IL-24蛋白，兩處理組IL-24蛋白表達(dá)量的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4. MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示：(1) pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后三種腫瘤細(xì)胞株的增殖均受抑制，且這種抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；(2) pCDNA3.1/RGD-IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用與pCDNA3.1/IL-24組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，

6、其對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯高于pCDNA3.1/IL-24組；(3) pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對(duì)正常細(xì)胞NHLF無(wú)生長(zhǎng)抑制作用。
　　 5. FITC-annexin V染色檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后腫瘤細(xì)胞凋亡明顯，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組早期凋亡細(xì)胞數(shù)多于pCDNA3.1/IL-24組

7、，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。
　　 6. Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后腫瘤細(xì)胞凋亡明顯，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組凋亡細(xì)胞數(shù)多于pCDNA3.1/IL-24組，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pCDNA

8、3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。
　　 7. Western blot 檢測(cè)各組bax，bcl-2蛋白表達(dá)。就腫瘤細(xì)胞而言，bax/bcl-2的比值在pCDNA3.1/RGD-IL-24組和pCDNA3.1/IL-24組是增高的，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組bax/bcl-2的比值增高更明顯。
　　 8. Western blot 檢測(cè)各組caspase 3的活化情況

9、。在腫瘤細(xì)胞中，pCDNA3.1/RGD-IL-24組和pCDNA3.1/IL-24組檢測(cè)到活化的caspase 3，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組caspase 3活化量較多。
　　 結(jié)論: 成功構(gòu)建IL-24突變體RGD-IL-24，并插入pCDNA3.1，構(gòu)建IL-24突變體的真核表達(dá)載體；在IL-24 cDNA序列中插入甘氨酸密碼子GGT不影響IL-24 mRNA 和IL-24蛋白的表達(dá)；RGD-IL-24能高