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1、該課題取成年幼鼠后肢屈趾肌腱以改良的組織塊法培養(yǎng)原代肌腱細(xì)胞并傳代,將質(zhì)粒pAdlox-IGF-1和pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)化DH5α并提取質(zhì)粒,用限制酶Hind III和BamH I 雙酶切并回收前者的短片段和后者長(zhǎng)片段,T<,4>DNA連接酶體外連接,轉(zhuǎn)化并提取連接產(chǎn)物,酶切及測(cè)序鑒定,即可得到IGF-1cDNA的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-IGF-1.并將pcDNA3.1(+)-IGF-1以脂多胺DOGS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的
2、大鼠屈趾肌腱細(xì)胞,進(jìn)行短暫表達(dá)研究.為了觀察外源性IGF-1對(duì)肌腱細(xì)胞分裂增殖的促進(jìn)作用,該實(shí)驗(yàn)用<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)肌腱細(xì)胞DNA的合成情況:轉(zhuǎn)染前24小時(shí) ,以2×<'5>/ml的濃度接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板,每孔150μl;然后分別于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)加入<'3>H-TdR(每孔1μCi)共培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)胞,檢測(cè)<'3>H-TdR摻入的CPM值.以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為對(duì)照.同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的爬片培養(yǎng),行I型膠原的免
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