草魚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8（FGF8）的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(Fibroblast．growth factor 8，F(xiàn)GF8)是最初從一種小鼠雄激素依賴性乳腺癌細(xì)胞系SC-3的培養(yǎng)液中分離出來的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員，與FGF18和FGF17屬于同一個(gè)亞家族。研究證實(shí)FGF8是一種組織發(fā)育過程中的重要分泌性信號(hào)分子，參與多種組織的發(fā)育，尤其在腦等外胚層器官的發(fā)育過程中起了重要作用。此外，F(xiàn)GF8能有效促進(jìn)組織損傷的修復(fù)，在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程也起重要的誘導(dǎo)作用。

2、本研究以草魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用了逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合RACE方法克隆草魚FGF8 cDNA序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行分析，旨在揭示魚類疾病的病理機(jī)制、了解草魚胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)、組織形成的生理調(diào)控機(jī)理。經(jīng)：PCR條件的優(yōu)化，最終克隆出了草魚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8(FGF8)的cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行深入的分析。 1．從草魚腦中提取總RNA。以總RNA為模板，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和試劑盒自帶的oligodT-3 sites

3、Adaptor primer為引物，合成第一鏈cDNA。接下來的PCR反應(yīng)中，以第一鏈cDNA為模板，人工合成的寡聚核苷酸引物為引物，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃變性60 see，48℃退火60 see，72℃延伸90 see，反應(yīng)40循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(DH5a)中，用于測(cè)序。結(jié)果顯示，草魚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8 cDNA序列長(zhǎng)度為887 bp，包括一個(gè)長(zhǎng)度為100個(gè)核苷酸的5’非編碼區(qū)序列(．

4、5'UTR)，起始密碼子(ATG)、編碼210個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)、終止密碼子(TGA)和一個(gè)包括加尾信號(hào)(AATAAA)、poly(A)信號(hào)的3'非編碼區(qū)序列(3'UTR)，3'非編碼區(qū)長(zhǎng)度為97個(gè)核苷酸。編碼區(qū)核苷酸長(zhǎng)度為687 bp。經(jīng)同源性比較分析，可以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為FGF8 cDNA序列。 2．草魚FGF8編碼的氨基酸多肽鏈全長(zhǎng)210個(gè)氨基酸，包含40個(gè)堿性氨基酸、16個(gè)酸性氨基酸。草魚FGF8蛋白質(zhì)的N端區(qū)

5、域包含一個(gè)氨基酸序列為MRLIPSRLSYLFLFAFCYYA的信號(hào)肽，切割位點(diǎn)在Ala22和Gln23之間。蛋白質(zhì)N-末端的信號(hào)肽被認(rèn)為是分泌蛋白的明顯特征，提示草魚FGF8蛋白是分泌蛋白。氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中在Asn37和Asn136氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)N-糖基化結(jié)構(gòu)，分別為Asn-Phe-Thr和Asn-Tyr-Thr。草魚FGF8推導(dǎo)蛋白的分子量Mw=24.68 kDa，等電點(diǎn)pI=10.93。其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含a-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊

6、、隨機(jī)卷曲等結(jié)構(gòu)形式。從分析圖中可以看出，β-折疊的比例比較高，其次是α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角、隨機(jī)卷曲含量最少。 3．系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示，鯉科魚類的FGF8蛋白很相似，斑馬魚、墨西哥脂鯉兩種鯉科魚類的FGF8蛋白均含有210個(gè)氨基酸，同源性97.1％。本實(shí)驗(yàn)克隆的草魚FGF8蛋白也具有210個(gè)氨基酸，與上述兩個(gè)鯉科魚類的FGF8氨基酸序列同源性達(dá)到97％以上。此外，草魚FGF8蛋白與其他物種也有很高的同源性，如與雞、斑點(diǎn)火蜥蜴、