海兔素改善大鼠酒精性肝損傷的效果及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:海兔素是一種溴代倍半萜，主要來源于紅藻凹頂藻屬海藻以及海兔中，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、抗氧化等生物學(xué)活性，對(duì)酒精暴露大鼠亦具有一定的肝臟保護(hù)作用。本研究通過探討海兔素對(duì)酒精暴露大鼠肝臟乙醇代謝酶、抗氧化能力、DNA損傷與修復(fù)、肝細(xì)胞凋亡、氧化/硝化應(yīng)激、線粒體功能以及內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路等的影響，以此闡明海兔素保肝效果及其可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.動(dòng)物分組及模型建立:兩月齡健康雄性Wistar大鼠10

2、0只，體重180-220g，按體重隨機(jī)分為5組，每組20只。酒精模型組以50％酒精8 ml·kg-1·d-1灌胃2w后，12ml·kg-1·d-1灌胃4w;海兔素低、中、高劑量組酒精劑量同模型組，同時(shí)每日分別給予海兔素50、100、150 mg·kg-1·d-1灌胃;正常組以等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)6w。末次灌胃12h后，大鼠稱重后給予7％水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，剝?nèi)「谓M織，分離紅細(xì)胞膜，提取肝細(xì)胞線粒體及微粒體，并計(jì)算肝指數(shù)。

3、r>　　2.肝臟病理學(xué)檢查:H-E染色觀察肝臟組織的病理學(xué)改變，透射電鏡觀察大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　3.肝功能及脂質(zhì)代謝水平評(píng)價(jià):用賴氏法檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性;微量酶標(biāo)法檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)的活性;用COD-PAP法測(cè)定血清中TC含量;GPO-PAP法測(cè)定血清及肝臟TG含量。
　　4.硝化應(yīng)激程度的評(píng)價(jià):用化學(xué)比色法檢測(cè)血清中一氧化氮合酶(NOS)活性;硝酸還原法測(cè)定血清中一氧

4、化氮(NO)含量;采用Western blotting檢測(cè)大鼠肝臟中iNOS蛋白表達(dá)水平的變化。
　　5.肝臟乙醇代謝酶活性的測(cè)定:制備10％肝組織勻漿，應(yīng)用比色法檢測(cè)肝臟乙醇脫氫酶(ADH)的活性;差速離心結(jié)合鈣沉淀法制備微粒體，硝基酚法檢測(cè)肝微粒體細(xì)胞色素P450亞酶2E1活性。
　　6.DNA氧化損傷程度的評(píng)價(jià):采用原位兩步Ⅳ型膠原酶灌注消化分離肝細(xì)胞，制備大鼠肝細(xì)胞懸液，通過彗星實(shí)驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)）測(cè)定肝細(xì)胞D

5、NA損傷程度;利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)檢測(cè)血漿中8-OHdG含量，評(píng)價(jià)DNA氧化損傷程度。
　　7.抗氧化綜合能力的分析:酶法測(cè)定肝臟胞漿乳酸/丙酮酸比值，反映NAD+/NADH比值;利用低滲一步溶血法和紅細(xì)胞膜熒光標(biāo)記法檢測(cè)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性;微板法檢測(cè)血漿中脂質(zhì)過氧化物(LPO)的水平;硫代巴比妥酸法(TBA法)測(cè)定肝臟和血漿中丙二醛(MDA)的含量;黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性;二硫代-2-硝

6、基苯甲酸(DTNB)比色法測(cè)定血清谷胱甘肽過氧物酶(GSH-Px)的活性;采用比色法測(cè)定肝臟過氧化氫(CAT)的活性。
　　8.線粒體功能評(píng)價(jià):差速離心法制備線粒體，測(cè)定線粒體懸液中Mn-SOD的活性和GSH含量;比色法測(cè)定線粒體呼吸酶鏈復(fù)合物(MRC)活性。
　　9.肝細(xì)胞凋亡的評(píng)估:采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。
　　10.Western blotting法檢測(cè)大鼠肝臟中iNOS、C

7、YP2E1以及線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路關(guān)鍵蛋白(Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3)的變化。
　　11.用Trizol試劑提取肝臟中總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝組織中CYP2E1 mRNA表達(dá)水平以及內(nèi)源性凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3)的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.海兔素改善酒精性肝損傷的效果評(píng)價(jià)
　　與

8、正常對(duì)照組相比，酒精模型組大鼠周體重有輕微下降，肝指數(shù)明顯增加(P＜0.05);與酒精模型組相比，各劑量海兔素干預(yù)組大鼠周體重均有所提高，但海兔素中、高劑量組大鼠肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)。HE染色病理觀察結(jié)果顯示，海兔素各劑量組肝臟脂肪變性明顯得到改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，與酒精模型組相比較，中、高劑量海兔素干預(yù)組，肝索排列逐漸恢復(fù)整齊，組織結(jié)構(gòu)趨向正常。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各劑量海兔素組胞漿脂滴數(shù)量減少，線粒體病變明顯減輕且數(shù)目

9、有所增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)退化與排列紊亂程度有所改善。在本研究中，酒精模型組大鼠血清中ALT、AST和ALP的活性顯著增加(P＜0.05)，而海兔素可有效抑制酒精誘導(dǎo)的血清ALT、AST和ALP的活性升高。此外，長(zhǎng)期大量酒精灌胃能使大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，血清TC、TG以及肝臟TG水平升高，而海兔素干預(yù)抑制了酒精攝入引起的這些變化，同時(shí)表現(xiàn)出良好的血脂調(diào)節(jié)作用。
　　2.海兔素對(duì)酒精暴露大鼠硝化應(yīng)激和肝臟酒精代謝酶的影響
　　與正常

10、組比較，酒精模型組大鼠血清TNOS和iNOS的活性明顯增加，NO含量升高，肝臟ADH及肝微粒體CYP2E1活性都有所增強(qiáng)(P＜0.05）;而不同劑量的海兔素組和酒精模型組相比，血清TNOS、iNOS活性以及NO含量均有不同程度地降低，且成劑量依賴關(guān)系，但ADH和CYP2E1活性儀150 mg/kg海兔素組同時(shí)抑制了它們活性的變化。此外，中、高劑量海兔素可明顯抑制大鼠肝組織中iNOS的蛋白表達(dá)(P＜0.05），且海兔素的攝入明顯降低了酒精

11、誘導(dǎo)的CYP2E1的蛋白和mRNA過表達(dá)。
　　3.海兔素對(duì)酒精暴露大鼠肝臟氧化損傷及氧化應(yīng)激的影響
　　酒精模型組胞漿NAD+/NADH比值、紅細(xì)胞膜流動(dòng)性均較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，而海兔素干預(yù)組可顯著拮抗酒精所致的NAD+/NADH的變化以及改善紅細(xì)胞膜流動(dòng)性，尤其是100和150 mg/kg劑量組。海兔素干預(yù)后可以明顯緩解因酒精誘導(dǎo)的血漿8-OHdG的升高，同時(shí)彗星實(shí)驗(yàn)表明海兔素組大鼠肝臟分離細(xì)胞DNA損

12、傷程度明顯減輕，其尾部DNA％、尾長(zhǎng)、尾距和Olive尾距值顯著性低于酒精模型組組(P＜0.05)。研究顯示，酒精模型組大鼠血/肝臟LPO和MDA的水平都顯著升高，相比之下，各海兔素干預(yù)組LPO和MDA水平均顯示出明顯的降低，并且海兔素干預(yù)組明顯抑制酒精誘導(dǎo)的GSH的下降，恢復(fù)SOD、GSH-Px以及CAT的活性。
　　4.線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路在海兔素干預(yù)的酒精性肝損傷中的作用
　　熒光顯微鏡AnnexinⅤ-FITC

13、/PI雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酒精模型組大鼠凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目明顯增加，且多為晚期凋亡細(xì)胞。而在海兔素處理組，肝細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，且多以早期凋亡為主。線粒體呼吸酶鏈復(fù)合物(MRC)活性檢測(cè)中，可見海兔素干預(yù)逆轉(zhuǎn)了酒精所致的MRCⅠ，Ⅲ和Ⅳ活性降低，與酒精模型組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。此外，Western blotting結(jié)果顯示，海兔素可上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制caspase-3和c

14、aspase-9的激活。同時(shí)，real-time PCR的結(jié)果也顯示，與酒精模型組相比，隨著海兔素作用劑量的增加，肝臟內(nèi)Bax、細(xì)胞色素C、caspase-9和caspase-3的mRNA的表達(dá)量逐漸下降，而Bcl-2基因mRNA表達(dá)的量逐漸增加，且差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.根據(jù)對(duì)肝臟指數(shù)、肝臟病理學(xué)的觀察、肝功能酶的評(píng)價(jià)以及脂質(zhì)代謝的檢測(cè)，初步證實(shí)了海兔素對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠肝損傷具有顯著的改善作用

15、。
　　2.海兔素對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能與①抑制iNOS活性，下調(diào)肝臟iNOS蛋白表達(dá)，減少NO的過量生成;②抑制大鼠肝臟ADH和微粒體CYP2E1活性，下調(diào)過表達(dá)的CYP2E1蛋白和mRNA表達(dá)水平有關(guān)。然而海兔素作為一種具有iNOS抑制作用且可調(diào)節(jié)肝臟酒精代謝酶的物質(zhì)能否成為有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷的藥物尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來佐證。
　　3.海兔素的補(bǔ)充可提高機(jī)體抗氧化能力抵抗酒精所致的氧化應(yīng)激，從而減輕脂質(zhì)