吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα及MUC5AC表達的影響.pdf

1、背景及目的：
　　近年來隨著環(huán)境的日益惡化，支氣管哮喘的發(fā)病率以每10年增加50％的速度持續(xù)上升，每年因哮喘死亡的人數(shù)達到250000以上。哮喘的發(fā)病原因眾多且相互聯(lián)系，主要涉及個人因素及環(huán)境因素，例如:基因、性別、感染、環(huán)境污染、飲食及肥胖等。其發(fā)病機制并未完全闡明，現(xiàn)認為炎癥、重構(gòu)及黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表現(xiàn)。目前糖皮質(zhì)激素是治療哮喘最有效的藥物，但糖皮質(zhì)激素的副作用限制了其廣泛使用。吡格列酮是過氧化物酶體增殖物活化

2、受體γ（peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ）激動劑，PPARγ作為調(diào)節(jié)糖代謝及脂類的轉(zhuǎn)錄因子與2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化及腫瘤等慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其還具有顯著地免疫調(diào)節(jié)、廣泛的抗炎及調(diào)節(jié)缺血反應(yīng)的作用。研究表明PPARγ激動劑除可以顯著的減少促炎細胞因子(IL-6及IL-1β等)的產(chǎn)生外，還可抑制哮喘模型小鼠肺嗜酸粒細胞及氣道高反應(yīng)性。提示吡格列酮對哮喘治療

3、有一定作用，但其作用機制有待進一步研究。
　　A型γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid receptor,GABAAR)屬受體門控離子受體超家族，α亞單位在GABAAR形成和功能中起重要作用。大量實驗顯示GABA合成酶和GABAAR能夠表達于氣道上皮細胞，進而組成了一個GABA系統(tǒng)，且哮喘時表達增強伴有黏液過度分泌。MUC5AC由氣道杯狀細胞分泌，反應(yīng)了氣道黏液分泌的情況。
　　本實驗通過觀察哮喘小鼠肺組織中

4、的GABAARα、MUC5AC的表達水平及吡格列酮干預(yù)后的改變，初步探討吡格列酮、GABAARα、MUC5AC之間的關(guān)系并藉此希望為哮喘的早期干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　材料方法：
　　按隨機數(shù)字表法，把30只（6～8周齡）清潔級雌性BALB/C小鼠分為3組:正常對照組、哮喘模型組和吡格列酮干預(yù)組，各組均10只。實驗的第1天、第8天，哮喘組及吡格列酮干預(yù)組小鼠腹腔注射(OVA)/Al(OH)3(含Al(OH)35mg和OVA

5、50ug)混合液0.2ml致敏，從實驗第21天起以20g/LOVA超聲霧化吸入30min/d激發(fā)，連續(xù)7d。吡格列酮干預(yù)組于霧化OVA前30min霧化吸入吡格列酮(5×10-5mol/L)。正常對照組小鼠的致敏液以及霧化激發(fā)均以0.9％的氯化鈉代替OVA。末次激發(fā)后24h，體積分數(shù)5％的水合氯醛400mg/kg麻醉小鼠，打開胸腔，結(jié)扎右肺門根部，生理鹽水0.3ml行左肺支氣管肺泡灌洗，共3次，合并得支氣管肺泡灌洗液(BALF)。灌洗液離

6、心后行肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)，取右肺組織浸入體積分數(shù)10％中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊，切片后部分行HE染色，部分用于免疫組化檢測MUC5AC、GABAARα蛋白的表達水平。切取左肺葉迅速放入液氮中，速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中用于RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法）檢測MUC5AC、GABAARαmRNA的表達水平。所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　實驗結(jié)果：
　　1、各組小鼠癥狀比較:哮喘組

7、小鼠在激發(fā)過程中出現(xiàn)打噴嚏、搔鼻、安靜少動、點頭樣喘息等典型的哮喘癥狀:吡格列酮干預(yù)組上述癥狀與哮喘組相比較，癥狀稍輕;正常對照組未見明顯異常癥狀。
　　2、各組小鼠BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù):正常對照組小鼠、哮喘組小鼠、吡格列酮干預(yù)組的BALF中細胞總數(shù)分別為:(6.50±0.04)×109/L、（12.48±0.09）×109/L、（6.69±0.04）×109/L;各組哮喘小鼠模型中BALF中嗜酸性粒細胞數(shù)為:（0.0

8、5±0.01）×109/L、（1.32±0.09）×109/L、（0.08±0.01）×109/L。
　　3、各組小鼠肺組織病理觀察:肺組織HE染色顯示對照組小鼠氣道黏膜上皮正常，氣道周圍未見炎性細胞浸潤，肺泡壁結(jié)構(gòu)未見破壞;哮喘組模型小鼠結(jié)構(gòu)破壞明顯，氣道黏膜不完整，可見上皮局部脫落，黏膜下可見充血水腫，黏膜層較正常對照組小鼠增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎癥細胞浸潤;吡格列酮干預(yù)組黏膜上皮相對完整，黏膜下充血水腫、氣道壁增厚

9、及炎癥細胞浸潤較哮喘組減輕。
　　4、各組小鼠肺組織中GABAARα、MUC5AC蛋白的表達:免疫組化法檢測肺組織中MUC5AC陽性染色僅見于支氣管上皮細胞，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)棕褐色顆粒，GABAARα蛋白大都表達于氣道上皮，陽性表達產(chǎn)物定位于細胞膜。3組小鼠肺組織均有一定程度的GABAARα、MUC5AC表達。哮喘組肺組織中GABAARα、MUC5AC蛋白表達強于吡格列酮干預(yù)組（P均＜0.05），且二者都高于對照組（P均＜0.05）。

10、
　　5、各組小鼠肺組織中GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA的表達:RT-RCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）結(jié)果顯示哮喘組小鼠肺組織GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA表達量均強于吡格列酮干預(yù)組（P均＜0.05），且兩者都高于對照組（P均＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、哮喘模型小鼠肺組織中GABAARα、MUC5AC表達增加，提示GABAARα可能與哮喘密切相關(guān)且可能與黏液過度分泌有關(guān)。
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