表皮生長因子誘導(dǎo)人口腔鱗癌細(xì)胞整合素β6基因表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這些生物學(xué)作用與整合素αVβ6有重疊。在健康成體的上皮組織中整合素αVβ6不表達(dá)，但在創(chuàng)傷愈合及腫瘤生長過程中呈上調(diào)表達(dá)。在人口腔鱗癌組織中整合素αVβ6高表達(dá)，并且EGF能夠誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，但是目前尚不清楚EGF是否能夠誘導(dǎo)整合素αVβ6的表達(dá)導(dǎo)致口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。整合素αVβ6是

2、由αV亞基和β6（ITGB6）亞基組成的跨膜異二聚體，只特異的在上皮組織中表達(dá)，β6亞基是調(diào)控整個(gè)異二聚體αVβ6表達(dá)的關(guān)鍵性亞基。因此，本研究主要探討EGF是否能夠誘導(dǎo)人口腔鱗癌SAS細(xì)胞中ITGB6基因的表達(dá)，并對(duì)參與調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究。
　　材料和方法:
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫沉淀（Wes

3、tern Blot）技術(shù)檢測EGF對(duì)人口腔鱗癌SAS細(xì)胞中ITGB6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，并用mRNA stability實(shí)驗(yàn)檢測ITGB6 mRNA表達(dá)是否與mRNA穩(wěn)定性有關(guān)；利用含有ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)不同長度片斷的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SAS細(xì)胞，確定EGF調(diào)控SAS細(xì)胞中ITGB6基因轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)控區(qū)；利用生物信息學(xué)方法并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測EGF調(diào)控SAS細(xì)胞ITGB6基因轉(zhuǎn)錄活性的可能順式作用元件及

4、與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子；利用定點(diǎn)突變、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法確定STAT3轉(zhuǎn)錄因子參與EGF誘導(dǎo)SAS細(xì)胞中ITGB6基因的表達(dá)；最后利用蛋白質(zhì)免疫沉淀法檢測SAS細(xì)胞中EGF對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STAT3表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果:
　　1. EGF誘導(dǎo)SAS細(xì)胞后，ITGB6 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著增加。
　　2. EGF調(diào)控SAS細(xì)胞中ITGB6基因轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)控區(qū)位于ITGB6基因5’側(cè)翼區(qū)

5、的-150~-421區(qū)域，該區(qū)域含有可能參與EGF誘導(dǎo)SAS細(xì)胞中ITGB6基因的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.利用定點(diǎn)突變、染色質(zhì)免疫共沉淀方法和RNA干擾實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)錄因子STAT3參與EGF誘導(dǎo)SAS細(xì)胞中ITGB6基因的表達(dá)，而且EGF可以活化SAS細(xì)胞中STAT3轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)論：
　　1. EGF可以誘導(dǎo)ITGB6 mRNA和蛋白質(zhì)在人口腔鱗癌SAS細(xì)胞中表達(dá)。
　　2. EGF能夠