TGF-β1誘導人口腔鱗癌細胞中整合素β6表達的分子機制.pdf

1、研究目的：
　　轉化生長因子-β1（TGF-β1）是一種具有多種生物功能的細胞因子，與腫瘤浸潤轉移相關的整合素avβ6在口腔鱗癌細胞中都異常高表達．而整合素avβ6的表達受關鍵性亞單位整合素β6(ITGB6)調控?；虻霓D錄調控與基因啟動子區(qū)轉錄因子的結合狀態(tài)及組蛋白乙?；揎椕芮邢嚓P。本研究擬通過研究β6基因啟動子區(qū)轉錄因子的活化狀態(tài)及組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)，研究TGF-β1調控β6表達的轉錄調控機制，為進一步探究整合素avβ6在

2、口腔鱗癌中過度表達的分子機制奠定基礎。
　　材料和方法：
　　用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人口腔鱗癌細胞，實時定量PCR以及Western blotting實驗檢測TGF-β1對β6表達的影響；利用mRNA穩(wěn)定性實驗檢測TGF-β1對β6的轉錄水平的影響是否與mRNA的穩(wěn)定性有關；進一步利用熒光素酶報告基因技術檢測β6基因啟動子中TGF-β1主要應答區(qū)；利用生物信息學方法并結合相關文獻預測調控口腔鱗癌細胞TGF-β

3、1誘導的β6基因轉錄活性的可能順式作用元件及與之結合的轉錄因子；利用定點突變和染色質免疫共沉淀方法確定調控口腔鱗癌細胞TGF-β1誘導的β6基因轉錄活性的主要順式作用元件及與之結合的反式作用因子；染色質免疫沉淀技術檢測TGF-β1誘導的β6啟動子區(qū)組蛋白乙?；揭约耙阴；D移酶在此區(qū)域的結合水平。
　　結果：
　　1. TGF-β1上調口腔鱗癌細胞整合素β6 mRNA和蛋白表達．mRNA穩(wěn)定性實驗證明TGF-β1不能增強β

4、6 mRNA的穩(wěn)定性而上調β6轉錄水平。
　　2.整合素β65’側翼區(qū)熒光素梅報告基因質粒pGL2-B6（-3/+208）、pGL2-B6（-150/+208）、pGL2-B6（-421/+208）分別轉染SAS細胞，分析TGF-β1對其影響，整合素β6啟動子區(qū)-150~-421 nt是TGF-β1的主要應答區(qū)，結合生物信息學方法預測到改區(qū)域主要轉錄因子有AP-1、C/EBP、SRF，c-Myb對AP-1、C/EBP、SRF、c-

5、Myb結合位點進行定點突變，結果顯示，AP-1、C/EBP、SRF的潛在結合位點可能涉及TGF-β1誘導的β6轉錄活性，進一步用染色質免疫沉淀技術（ChIP）發(fā)現(xiàn)，TGF-β1促進轉錄因子JunB、C/EBPα、SRF在口腔鱗癌細胞中與β6基因啟動子區(qū)-150~-421 nt結合增加，同時Western blotting結果顯示，TGF-β1促進JunB、C/EBPα和SRF蛋白表達。
　　3.染色質免疫沉淀檢測到TGF-β1誘導

6、的β6啟動子區(qū)-150~-421 nt的乙?；揭约敖M蛋白乙?；D移酶CBP結合量升高，其中組蛋白H3乙?；皆赥GF-β1作用2h時達到最高，組蛋白H4乙酰化水平和CBP結合量則在0.5h時達到最高。當用siRNA使CBP基因表達靶向沉默后，TGF-β1誘導的β6 mRNA以及蛋白水平顯著降低。使用去乙酰化酶抑制劑LBH589（10μM）、SAHA(1μM)作用于SAS細胞，能使TGF-β1誘導的β6 mRNA以及蛋白表達水平升高

7、。
　　結論：
　　1. TGF-β1誘導整合素β6 mRNA以及蛋白表達水平上調，轉錄水平調控是關鍵。
　　2.整合素β6啟動子區(qū)對TGF-β1的主要應答區(qū)位于-150~-421 nt，TGF-β1使此區(qū)域的反式作用因子AP-1亞單位JunB，C/EBPα，SRF結合增多從而使整合素β6啟動子轉錄活化
　　3.整合素β6啟動子區(qū)-150~-421 nt組蛋白乙?；缴邊⑴cTGF-β1誘導的整合素β6轉錄活化