中國木犀科苦丁茶種質資源的RAPD和ISSR分析.pdf

1、本課題應用RAPD和ISSR分子標記技術，系統(tǒng)地研究了木犀科苦丁茶種質資源的親緣關系和遺傳多樣性。主要研究結果如下： 1．在CTAB提取法的基礎上，建立了一種能有效去除多糖等干擾物質的總DNA提取方法。用該方法提取木犀科苦丁茶總DNA簡便、快速，并可得到高質量的DNA。 2．通過對木犀科苦丁茶RAPD和ISSR分析反應體系中主要影響因子進行優(yōu)化，確立了這兩種分子標記技術用于木犀科苦丁茶種質資源研究時的最適宜反應條件。其中

2、RAPD的最適宜反應條件為：10×buffer2．5μl，2．5 mmol/L MgCl2，200μ mol/L dNTPs，Taq酶2．0 U，引物10 pmol，DNA模板80 ng，最后用無菌超純水補足至25μl； PCR擴增程序為：94℃預變性4min，然后按94℃變性30 s，37℃退火45 s，72℃延伸120 s，進行40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。ISSR的最適宜反應條件為：10×buffer2．5μl，2．0～

3、3．0 mmol/L MgCl2，150～300μmol/L dNTPs，Taq酶1．0～1．5 U，引物0．4～0．5μmol/L，DNA模板5～320 ng，最后用無菌超純水補足至25μl； PCR擴增程序為：94℃預變性4 min，然后按94℃變性40 s，50～54℃退火45 s，72℃延伸120 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸8 min。在上述條件下可得到穩(wěn)定性好、重復性高的PCR擴增結果。 3．在上述反應條件下篩

4、選出20條RAPD有效引物和10條ISSR有效引物。利用這20條RAPD引物對木犀科苦丁茶8個物種[包括粗壯女貞、麗葉女貞（又名興山蠟樹，L．henryi Hemsl．）、日本女貞（L．japonicym Thunb．）、日本毛女貞（L．japonicium Thunb． var。pubscens Koidz）、女貞（L．lucidum Ait．）、序梗女貞（L．pedunculare Rehd）、牛矢果（Osmanthus masum

5、uranus Hayata）和川滇蠟樹（L．delavayanm Hariot）]共21份種質材料進行擴增，共獲得427條譜帶，PPB（Percentage of polymorphic bands）為97．7％，個體間遺傳相似系數在0．1522～0．8322，平均遺傳相似系數為0．5466；利用10條ISSR引物對木犀科苦丁茶8個物種（同上）共39份種質材料進行擴增，共獲得246條譜帶，PPB為98．4％，供試個體間的遺傳相似系數在0

6、．1496～0．9518，平均GS為0．6628。基于RAPD和ISSR遺傳相似系數的UPGMA聚類分析圖基本一致，均可把供試材料完全分開并表明它們之間的親緣關系。分析結果表明，木犀科苦丁茶各物種間存在著較大的遺傳差異，RAPD和ISSR分子標記技術均可把供試材料明顯分開并表明物種間的親緣關系，兩種標記技術所得的結果基本一致；兩種標記技術的結果均表明，日本毛女貞與序梗女貞的親緣關系在所有的供試物種中最近，而與日本女貞的關系較遠。據此，作

7、者認為，關于日本毛女貞是否應該劃分為日本女貞種下一變種，或是可以獨立劃分為一個種的問題，尚需進一步研究。此外，兩種分子標記技術的分析結果均支持紫莖女貞（L．pururascens Y．C．Yang）歸并為粗壯女貞。 4．用所篩選出的19條RAPD隨機引物和10條ISSR引物對79份不同地域來源的粗壯女貞種質材料進行擴增，分別共擴增出369條和181條譜帶，多態(tài)性帶百分率分別為86．0％和89．0％，各種質材料間的GS值變化范圍分

8、別為0．4664～0．9736和0．4167～0．9785，平均GS值分別為0．6623和0．6179。這表明RAPD和ISSR可以應用于粗壯女貞種內遺傳多樣性分析；同時也表明，粗壯女貞種內不同地域來源或不同類群種質材料之間有著豐富的遺傳多樣性，存在著較大的遺傳差異?；赗APD和ISSR遺傳相似系數的UPGMA聚類結果基本相似，各供試材料均按地理起源聚類，可把所有粗壯女貞供試材料分為兩大類群：A類群（貴州—四川群類）和B類群（云南群類

9、）。 5．應用10條ISSR引物在24份女貞種質材料中共擴增出157條譜帶，檢測到79．6％的多態(tài)性帶，各種質材料間的GS值在0．5185～0．8478之間，平均GS值為0．6718。由此可見，女貞種內存在較大的遺傳變異，具有豐富的遺傳多樣性。從聚類結果看，產自同一地方的材料基本上是聚在一起，但也有個別材料的聚類關系與其形態(tài)特征密切相關，而與其地理起源距離的關系不甚密切。 6．綜合分析本課題的研究結果表明：RAPD分子標

10、記技術和ISSR分子標記技術均可有效地應用于木犀科苦丁茶種質資源的的遺傳多樣性分析，親緣關系及分類地位研究，以及種質材料的起源地域分析或類群劃分等研究領域。但就實驗條件的穩(wěn)定性或實驗結果的可重復性而言，ISSR標記技術要優(yōu)于RAPD標記技術，且ISSR能揭示更多的多態(tài)性，具有更強的分辯力。Mantel檢測表明，在種間水平和種內水平上，這兩種標記的分析結果均呈極顯著的相關性，r=0.8985（物種間）和r=0．9705（粗壯女貞材料間）。