整合非靶標和靶標代謝組學模式的白念珠菌被膜形成及藥物干預(yù)機制研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans）是一種常見的條件致病型真菌，可通過多種機制對人體的免疫系統(tǒng)及各種抗真菌藥物產(chǎn)生極大的耐受作用，使白念珠菌感染的治療一直是臨床上棘手的難題。
　　 近年來，代謝組學技術(shù)的發(fā)展為表征真菌代謝物調(diào)控模式提供了有力手段，并已應(yīng)用于白念珠菌代謝輪廓的分析。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝作為代謝通路調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，在白念珠菌形態(tài)變化過程中扮演關(guān)鍵角色。本研究在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

2、，構(gòu)建了靶標和非靶標代謝物分析方法，并結(jié)合代謝組學數(shù)據(jù)挖掘和藥理效應(yīng)驗證等手段對白念珠菌形態(tài)變化以及中藥活性單體的抗菌藥效機制進行了研究，旨在為真菌代謝組學相關(guān)研究提供方法參考。
　　 針對氨基酸的極性和質(zhì)譜響應(yīng)特征，構(gòu)建以多孔石墨碳柱為載體的離子對色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（IP-PGC-TOF/MS），在基質(zhì)效應(yīng)、精密度、重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性考察的基礎(chǔ)上，利用三種同位素標記的氨基酸內(nèi)標，建立了白念珠菌中22種關(guān)鍵氨基酸的非衍

3、生化定量分析方法，最低檢測限和最低定量限均達到納克級。此方法的建立為后續(xù)的白念珠菌靶標與非靶標研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 以浮游型和被膜型白念珠菌為對象，在已有的GC-MS研究基礎(chǔ)上，為開展對極性不揮發(fā)代謝物的研究，應(yīng)用IP-PGC-TOF/MS方法，結(jié)合代謝指紋譜技術(shù)和定量代謝組學技術(shù)，針對白念珠菌的被膜形成機制進行了更深入研究。在非靶標研究發(fā)現(xiàn)16個差異代謝物的基礎(chǔ)上，通過對白念珠菌胞內(nèi)22種氨基酸的定量分析，精確刻畫了氨基酸的

4、代謝水平變化，發(fā)現(xiàn)了一系列和被膜形成相關(guān)的代謝生物標志物，主要與鳥氨酸、賴氨酸代謝相關(guān)，其中鳥氨酸在生物被膜中明顯降低。進一步通過鳥氨酸脫氫酶(ODC)基因敲除菌SPE1的代謝物活性測試和疏水性實驗驗證了鳥氨酸代謝在生物被膜形成中的關(guān)鍵作用。
　　 我們將構(gòu)建的靶標和非靶標結(jié)合的代謝分析方法應(yīng)用于中藥抗菌活性單體黃芩素作用于白念珠菌的代謝調(diào)控機制研究。通過GC-MS與IP-PGC-TOF/MS代謝輪廓分析，分別篩選到20個和21

5、個黃芩素給藥相關(guān)的差異代謝物，主要參與糖酵解、應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、磷脂代謝、鞘脂代謝等通路，并完成對黃芩素給藥組和對照組胞內(nèi)22個氨基酸的定量，揭示了黃芩素可能通過干擾能量代謝，細胞膜功能以及對感應(yīng)分子合成的調(diào)節(jié)起到抗白念珠菌的作用。
　　 本論文探索構(gòu)建的靶標與非靶標結(jié)合的代謝組學研究模式成功運用于白念珠菌的研究，相較于傳統(tǒng)研究策略，本方法體系具有更靈敏地代謝物識別能力以及更精確的定量能力，可為真菌形態(tài)變化和藥效