臨床白念珠菌耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái),深部真菌感染明顯增加,其中白念珠菌是深部真菌感染中最為常見(jiàn)的致病菌。由于三唑類(lèi)抗真菌藥物尤其是氟康唑(Fluconazole)療效確切,耐受性好,因而在臨床上廣泛應(yīng)用。隨著氟康唑長(zhǎng)療程使用,因出現(xiàn)耐藥株而導(dǎo)致治療失敗的報(bào)道與日俱增。目前已確定的白念珠菌主要耐藥機(jī)制包括：主要易化載體超家族蛋白MDR1基因的過(guò)表達(dá)；編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的CDR1,CDR2基因的高表達(dá)；藥物作用靶酶基因ERG11的高表達(dá)和突變等。CAP1基因編碼的Ca

2、plp是MDR1的轉(zhuǎn)錄激活因子,在白念珠菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控的作用。TAC1基因編碼的Taclp是CDR1,CDR2的重要轉(zhuǎn)錄激活因子。CAP1可介導(dǎo)MDR1基因的上調(diào)和持續(xù)性高表達(dá),而TAC1可介導(dǎo)CDR1、CDR2基因的上調(diào)和持續(xù)性高表達(dá),最終產(chǎn)生耐藥性。 本課題研究的目的是明確長(zhǎng)海醫(yī)院自臨床患者中分離的白念珠菌對(duì)氟康唑等抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制,了解菌株產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)在原因,尋找對(duì)這些耐藥菌株耐藥性產(chǎn)生的

3、重要的分子機(jī)制,為預(yù)測(cè)菌株耐藥性產(chǎn)生奠定理論基礎(chǔ)。 采用微量液基稀釋法測(cè)定氟康唑?qū)εR床分離白念珠菌的最低抑菌濃度；以篩選出敏感菌株和耐藥菌株；實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)方法檢測(cè)耐藥相關(guān)基因CDR1,CDR2,MDR1,ERG11,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CAP1及TAC1的表達(dá)水平；用羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羅丹明6G在CDR1,CDR2基因表

4、達(dá)差異的白念珠菌中的外轉(zhuǎn)運(yùn)情況；以抽提的白念珠菌基因組DNA為模板,對(duì)ERG11,TAC1,CAP1基因的編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得全長(zhǎng)片段并測(cè)序,利用NCBIDatabase和Candida Genome Database提供的BlastN和BlastX方法進(jìn)行比對(duì),尋找是否存在有意義的突變。 本課題研究證實(shí)臨床耐藥菌株中耐藥相關(guān)基因CDR1、CDR2、MDR1的高表達(dá)與其耐藥性產(chǎn)生密切相關(guān)；轉(zhuǎn)錄因子TAC1高表達(dá)調(diào)控CDR

5、1基因的高表達(dá),是CDR1高表達(dá)引起菌株耐藥性產(chǎn)生的重要原因。羅丹明6G外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)證明CDR1、CDR2基因的高表達(dá)引起藥物外轉(zhuǎn)運(yùn)增加,是菌株耐藥性產(chǎn)生的重要原因。ERG11變異的檢測(cè)只發(fā)現(xiàn)有D116E,E266D兩個(gè)位點(diǎn)的變異與耐藥性產(chǎn)生密切相關(guān),未檢測(cè)到國(guó)內(nèi)外其他文獻(xiàn)中提及的其他變異。而對(duì)CAP1和TAC1的測(cè)序未發(fā)現(xiàn)與耐藥性產(chǎn)生密切相關(guān)的變異位點(diǎn),說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子的變異可能不是耐藥性產(chǎn)生的重要原因。 本課題研究的部分菌株中,確