雞尾酒組織工程骨的構(gòu)建及其對脊柱融合的誘導(dǎo).pdf

1、目的：自體骨移植作為脊柱融合的金標(biāo)準(zhǔn)，存在諸多的限制和并發(fā)癥。我們前期研究顯示骨髓間充質(zhì)細(xì)胞作為脊柱融合的細(xì)胞來源，與天然自體骨膠原支架復(fù)合促進了骨的形成。本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上，進一步探索細(xì)胞-生長因子-生物支架之間的相互作用，間充質(zhì)干細(xì)胞在生長因子的誘導(dǎo)下，在生物支架內(nèi)的定向分化和三維成骨的可能性，并在在動物模型中確認(rèn)生長因子-細(xì)胞-支架雞尾酒組織工程骨應(yīng)用于脊柱融合的安全性、誘導(dǎo)成骨效能。為組織工程骨的體外構(gòu)建提供內(nèi)在機理的理

2、論依據(jù)以及實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用體外培養(yǎng)的方法，探索構(gòu)建雞尾酒組織工程骨的最佳配方和工藝流程。從新西蘭兔髂嵴采集骨髓細(xì)胞，采用貼壁分離的方法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。將細(xì)胞以不同的密度載入天然骨膠原支架（natural bone collagen scaffold，NBCS），在相同濃度的生長因子OP-1(osteogenic protein-1)的誘導(dǎo)下共培養(yǎng)4周;將細(xì)胞以相同的密度載入天然膠原支架，以不同濃度的生長

3、因子OP-1誘導(dǎo)共培養(yǎng)4周。以組織學(xué)切片HE染色，成骨細(xì)胞計數(shù)，半定量PCR，堿性磷酸酶活性，免疫組化等方法檢測其成骨能力。比較不同細(xì)胞密度和不同濃度的生長因子對富集化骨髓細(xì)胞在生物支架中的擴增和成骨分化的影響，尋求雞尾酒組織工程骨的最佳配比，包括最佳細(xì)胞密度和最佳生長因子濃度的探索。
　　2.確定雞尾酒組織工程骨的配方后，采用新西蘭兔腰椎橫突間融合的模型，驗證生長因子-細(xì)胞-支架雞尾酒組織工程骨的安全性、誘導(dǎo)成骨效能。該材料植入

4、體內(nèi)6周后，采用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、成骨相關(guān)基因的表達(dá)，影像學(xué)等方法評估融合區(qū)域的新生骨成骨水平。
　　結(jié)果：
　　1.在最佳細(xì)胞密度的探索中，組織學(xué)切片HE染色，成骨細(xì)胞計數(shù)，半定量PCR，堿性磷酸酶活性，免疫組化等方法顯示密度達(dá)到106/scaffold時細(xì)胞在支架內(nèi)達(dá)到最佳融合。
　　2.在最佳生長因子濃度的探索中，組織學(xué)切片HE染色，成骨細(xì)胞計數(shù)，半定量PCR，堿性磷酸酶活性，免疫組化等方法顯示生長因

5、子OP-1濃度為100ng/ml時細(xì)胞在支架內(nèi)達(dá)到最佳融合。
　　3.以上述確認(rèn)的最佳細(xì)胞密度，最佳生長因子濃度，構(gòu)建雞尾酒組織工程骨植入新西蘭兔腰椎橫突間融合，6周后形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)，成骨相關(guān)基因的表達(dá)，影像學(xué)等方法檢測顯示相對于自體骨移植組，組織工程骨更為安全，更為方便，更為有效。
　　結(jié)論：細(xì)胞-生長因子-生物支架之間存在復(fù)雜的相互作用。在特定的支架下，細(xì)胞密度和生長因子濃度分別影響著干細(xì)胞的行為。在我們的

6、體系中，探索出了最佳的細(xì)胞密度和最佳的生長因子濃度。間充質(zhì)干細(xì)胞在生長因子的誘導(dǎo)下，在天然骨膠原支架內(nèi)定向分化三維成骨，顯示了體外構(gòu)建生長因子-細(xì)胞-支架雞尾酒組織工程骨的可行性，并找到了一個合理有效的配方。接著在動物模型中確認(rèn)生長因子-細(xì)胞-支架雞尾酒組織工程骨應(yīng)用于脊柱融合的安全性、誘導(dǎo)成骨效能。結(jié)果證明，體外構(gòu)建雞尾酒組織工程骨植入體內(nèi)良好的骨生成能力及安全性能，其不但成骨性能優(yōu)于自體骨移植，同時也可以解決臨床自體骨移植中來源受限